Embryonert kyllingegg

Inokulere embryonerte kyllingegg med meslingervirus for vaksineproduksjon

Det embryonerte kyllingegget (også eggkultur, inkubert kyllingegg eller kyllingembryokultur) er en spesiell laboratorieteknikk i virologi for multiplikasjon og isolering av virus . Appendiksorganene til et preinkubert kyllingembryo eller sjelden embryoet selv inokuleres med virusholdig materiale, og etter noen dager gjenopprettes de nyopprettede virusene og videreformeres eller undersøkes. Andre patogener som formerer seg intracellularly reproduseres også sjelden i hønsegg, som rickettsia og chlamydia . Den embryonerte kyllingeggmetoden ble utviklet av Ernest Goodpasture i 1932 og optimalisert for virusreplisering i 1946. Fram til utviklingen av cellekulturteknologi på 1950-tallet var dette den eneste metoden for målrettet replikering av virus i laboratoriet; bare infeksjon av testdyr var mulig frem til da. I dag har dyrking i høneegg i stor grad blitt fortrengt av cellekultur og er begrenset til noen få vira som ingen eller utilstrekkelig reproduksjon i cellekulturer er mulig for. Bruken i virusdiagnostikk er begrenset til enkelttilfeller eller patogener av dyresykdommer der det fortsatt kreves en undersøkelse av det embryonerte høneegget ved lov. Det embryonerte høneegget er fremdeles viktigst i dag i dyrking av orthomyxovirus , spesielt i industriell produksjon av vaksiner og isolering av influensavirus .

Teknikk for det embryonerte kyllingegget

Inkubator for inkuberte kyllingegg

Screening av inkuberte kyllingegg

Bare kyllingegg fra smittestyrte kyllingpopulasjoner brukes til å formere virus, ettersom embryoet ikke må være infisert med naturlige patogener som forårsaker kyllingesykdommer. Disse eggene kalles også spesifiserte patogenfrie (SPF-egg). For å oppnå en passende størrelse på embryoet inkuberes de befruktede kyllingeggene videre i spesielle inkubatorer i 5 til 14 dager ved 38 ° C og en relativ fuktighet på 60%, avhengig av infeksjonsteknikken som ble valgt senere . Disse inkubatorene har også en dreieinnretning som beveger eggene regelmessig. Med en spesiell fluorescerende skjerm kan utviklingen av embryoet observeres etter at eggene er fjernet (" ren "), døde eller ikke-befruktede egg sorteres ut. CEF-celler produseres også av embryonerte kyllingegg .

Vaksinering av vedleggsorganene

Vanligvis er det ikke selve embryoet som inokuleres, men vedhengsorganene. Avhengig av virusarten eller spørsmålet (reproduksjon eller virusdeteksjon), er dette plommesekken , amnionen , allantois eller den korioniske allantoiske membranen (CAM). Siden disse viser en optimal størrelse og mottakelighet for virus for inokulering på forskjellige tidspunkter under embryonal utvikling, varierer også lengden på inkubasjonstiden for eggene som brukes. Den beste tiden for infeksjoner i plommesekken er 5 til 7 dager etter befruktning, for amnion og allantois 10 dager, for CAM 11 til 12 dager. Hvis inokulasjonen finner sted for tidlig, er ikke vedleggsorganet tilstrekkelig stort, hvis det foregår for sent, kan stadig mer hemmende påvirkninger av immunforsvaret (inkludert dannelse av immunglobulin Y ) eller en redusert følsomhet for organene forhindre vellykket infeksjon.

Vaksinering utføres under sterile forhold for å unngå bakteriell forurensning. Etter desinfisering åpnes eggeskallet med et lite slag. Ved inokulering av CAM foregår dette på siden av egget som embryoet hviler på innsiden av; i alle andre vedleggsorganer åpnes den stumpe eggpolen. Omtrent 0,1 til 0,2 ml virusholdig væske ( inokulum ) injiseres i den tilsvarende strukturen ved bruk av en kanyle . Deretter lukkes bollen med lim eller voks. Etter en dag med videre inkubasjon blir eggene sjekket med et lysapparat, og døde embryoer blir sortert ut som vaksinasjonsskader. Etter ytterligere en til seks dager kan de multipliserte virusene fås fra allantoisk eller fostervann ( eggehvite ) eller CAM og eggeplomme. Før dette lagres egget over natten ved 4 ° C slik at fosteret dør og blodkarene trekker seg sammen. Vanligvis følger ytterligere rensingstrinn, slik som filtrering eller ultrasentrifugering , for å oppnå viruspreparater som er så rene som mulig.

Vurdering av embryoutvikling

De inokulerte eggene blir regelmessig røntgen, vanligvis daglig, og embryoets utviklingsstatus blir vurdert. Hvis bakteriekontaminering og inokulasjonsskade er utelukket, kan embryoets død indikere virusreplikasjon, dette kan for eksempel observeres etter inokulering av eggeplomme med herpes simplex-virus . Andre makroskopisk synlige tegn på virusreplikasjon er økte vaskulære markeringer i embryoet, tegn på betennelse , petechial blødning eller misdannelser . Når de er vaksinert med koppevirus , herpes simplex-virus og Rous sarkomvirus, vises mørke, flekkete endringer kjent som "pocks" på CAM . Disse er så karakteristiske at de kan brukes til å stille en diagnose når et virus oppdages. I de fleste tilfeller følger forskjellige ytterligere undersøkelser for å identifisere patogenet, for eksempel en elektronmikroskopisk undersøkelse, en hemagglutinasjonstest eller direkte påvisning av viruskomponenter ( antigener og nukleinsyre ) for presis inntasting.

Viktigheten i virusdiagnostikk

Betydningen av det embryrerte høneegget for virusisolering og virusdiagnose er begrenset, når det gjelder humane virus er det nå begrenset til isolering og typing av influensavirus. Ved isolering av ukjente, nye patogener, i tillegg til molekylære metoder, cellekultur og elektronmikroskopi, brukes også embryonerte høneegg. I veterinærmedisin dyrkes det også en rekke patogener i eggkultur , inkludert representanter for koppevirus , orthomyxovirus , herpesvirus , togavirus og forskjellige fuglevirus. Tabellen nedenfor gir en oversikt over de viktigste patogenene og deres oppførsel i embryonerte høneegg. Noen virus kan bare spres vellykket og med et akseptabelt utbytte i kyllingegget hvis villtypen har blitt tilpasset kyllingegget gjennom flere passasjer ( blinde passasjer ).

Vaksineproduksjon i det embryonerte høneegget

Den store fordelen med virusreplisering i embryonerte høneegg er det høye virusutbyttet. Dette ble brukt i produksjonen av forskjellige vaksiner allerede på 1960-tallet, for eksempel for å skaffe nok råstoff til døde vaksiner ( splittede vaksiner ) mot meslingervirus ( meslingervaksiner ) og forskjellige influensavirus ( influensavaksiner ). Spesielt med sistnevnte har reproduksjonen i cellekulturer ennå ikke nådd tilstrekkelig høye viruskonsentrasjoner, slik at det embryrerte høneegget fremdeles avgjør den industrielle produksjonen av influensavaksiner den dag i dag. Problemet med denne metoden er imidlertid den tidkrevende rengjøringen av eggmaterialet, som alltid etterlater spor etter eggproteiner og derfor ikke kan administreres hvis det er kyllingeproteinallergi .

hovne opp

• SJ Flint, LW Enquist, VR Racaniello, AM Skalka: Principles of Virology. Molekylærbiologi, patogenese og kontroll av dyrevirus. 2. utgave. ASM-Press Washington DC 2004, ISBN 1-55581-259-7 , s. 30.
• Frank Fenner , BR McAuslan og andre: Biologien om dyrevirus. 2. utgave. Academic Press, New York NY et al. 1974, ISBN 0-12-253040-3 , s. 42f.

Individuelle bevis

1. ^ EW Goodpasture, AM Woodruff, GJ Buddingh: Vaksinell infeksjon i chorio-allantoisk membran i kyllingembryoet . Amer. J. Pathol. (1932) 8: s. 271
2. ↑ WIB Beverige, FM Burnet: Dyrking av virus og rickettsiae i kylling embryo . Med. Res. Council Spec. Rept. Ser (1946) 256