Fasekontrastmikroskopi

Den eneste celle Ammoniakk tepida i fasekontrast-metoden

Den fasekontrast metode (fra gresk φασις, phasis "utseende" og Latin contra stare "å stå i opposisjon") er en bilde metode i lys mikroskopi . Dette benytter seg av det faktum at, i tillegg til amplituden , endres fasen av lysbølger også når de passerer gjennom et medium, avhengig av dets brytningsindeks . På denne måten er det mulig å direkte avbilde strukturer som bare har lav egenkontrast og som bare vil være synlige med lysfeltmikroskopi med kunstig farging.

Fasekontrastmikroskopi er utbredt i undersøkelsen av biologiske prøver der objektsdelene bare skiller seg litt ut i lysabsorpsjon , men i brytningsindeks. Fasekontrastmetoden ble utviklet i 1932 av den nederlandske fysikeren Frits Zernike og introdusert i mikroskopisk praksis i 1941 av Jena Carl-Zeiss-Werke . I 1953 mottok Zernike Nobelprisen i fysikk for sin oppdagelse .

Kontrast i lysmikroskopi

Amplitude og faseobjekt

Synligheten av detaljer i et bilde avhenger av oppløsningen og kontrasten til bildet. Spesielt svekkes lysmikroskopien av biologiske objekter i mange tilfeller av den dårlige kontrasten til bildene som genereres.

Amplitude og faseobjekter

Amplitude objekter

Når du ser i lyse felt, er det bare områder i bildet som absorberer lys til en viss grad sammenlignet med omgivelsene som er tydelig synlige. Enten gjennom generell lysabsorpsjon (mørkere) eller gjennom spektralt spesifikk lysabsorpsjon (naturlige farger). Slike objekter kalles også amplitudeobjekter.

Faseobjekter

Mer eller mindre klare og fargeløse gjenstander har liten effekt på amplituden til det innfallende lyset og virker bare synlige hvis de som unntak har en veldig sterk forskjell i brytningsindeksen sammenlignet med omgivelsene. Som regel har slike objekter en veldig dårlig kontrast, siden det menneskelige øye ikke kan oppfatte faseforskjeller som sådan. Siden slike objekter, i motsetning til amplitudeobjekter, ikke gir noen signifikant forskjell i amplituden til det innfallende lyset, men bare en forskjell i fase, kalles de også faseobjekter.

Metoder for å øke kontrasten

Det er flere metoder for å øke kontrasten. For eksempel er individuelle gjenstander eller deres komponenter spesifikt farget med fargestoffer . En annen metode er at belysning for å redusere ved iris av belysningsapparatet ( kondensatoren innsnevret). Som et resultat vises deler av objektet med forskjellige brytningsindekser med større kontrast. Imidlertid har denne metoden den alvorlige ulempen at oppløsningen til bildet er kraftig redusert, fordi oppløsningen til mikroskopet avhenger av den numeriske blenderåpningen for objektbelysningen. I tillegg gjør kunstig farging det vanskelig å vise levende biologisk materiale, siden mange celler går til grunne som et resultat av fargestoffet.

Prinsipp for fasekontrastmetoden

Fasekontrastmetoden fra Frits Zernike bruker forskjeller i brytningsindeksen og tykkelsen på objektet for å generere en lys-mørk kontrast uten å redusere lysåpningen og dermed oppløsningen til mikroskopet betydelig. Siden lys forplantes med forskjellige hastigheter i medier med forskjellige brytningsindekser, er det en faseforskjell når det passerer gjennom et objekt som er optisk tettere enn omgivelsene sammenlignet med lyset som ikke passerer gjennom dette objektet.

For å være i stand til å representere denne faseforskyvningen i lysstyrkeforskjeller, er en fasering i objektivet og en ringmembran i kondensatorlinsen innebygd i et fasekontrastmikroskop . Ringmembranen begrenser forekomsten av lys på prøven til en viss innfallsvinkel. Hvis det ikke er noen prøver under mikroskopet, treffer alt bakgrunnslyset som faller gjennom membranen fasringen. Dette består av et materiale som demper lyset og samtidig forskyver sin fase med 90 °.

Imidlertid, hvis et preparat, for eksempel en prøve med gjennomsiktige celler, bringes inn i strålebanen, blir lyset avbøyd delvis på cellene. I motsetning til det ikke-nedbragte lyset, løper imidlertid dette diffrakterte objektlyset overveiende ikke gjennom fasringen og blir følgelig ikke påvirket av det. Imidlertid forårsaker diffraksjonen i prøven også et faseskift avhengig av brytningsindeksen.

I bildeplanet er det nå interferens mellom bakgrunn og objektlys. For å oppnå størst mulig kontrast, må faseskiftet til bakgrunnslyset i fasringen være innstilt på en slik måte at bakgrunnslyset svekker objektlyset så mye som mulig når det forstyrrer objektlyset. Faseringen i linsen må derfor dimensjoneres omtrent i samsvar med de vanligste brytningsindeksene og tykkelsen på gjenstandene som blir sett på. Som et resultat ser objektet nå for det meste mørkt ut mot bakgrunnen. Dette er kjent som positiv fasekontrast . Når det gjelder gjenstander med spesielt høy brytningsindeks ( f.eks. Endosporer av bakterier ), endres kontrasten, og de vises lysere enn bakgrunnen.

I en metode som sjelden brukes, dimensjoneres faseringa på en slik måte at kontrasten blir reversert selv med konvensjonelle objekter, dvs. de ser lyse ut på en mørkere bakgrunn; dette er kjent som negativ fasekontrast .

Ved å bruke fasekontrastmetoden forbedres ikke oppløsningen til et mikroskop utover diffraksjonsgrensen .

  • Sammenligning av forskjellige mikroskopimetoder ved hjelp av et utvalg av silkepapir .

  • Fasekontrast, kontrast genereres av interferens av forskjellige faselysbølger etter at de har passert gjennom objektet.

  • Brightfield mikroskopi , kontrast skapes ved å absorbere lys i objektet.

  • Polariserende mikroskopi , kontrast skapes ved å rotere polarisert lys i prøven.

  • Mørk feltmikroskopi , kontrast genereres av lyset spredt i objektet.

applikasjoner

Trichoderma harzianum med konidiofores
fasekontrastmikroskopi

Fasekontrastmetoden brukes oftest i lysmikroskopi av biologiske gjenstander. Spesielt når man observerer celler som nesten er usynlige i et normalt lysmikroskop, oppstår bilder med høy kontrast uten behov for flekker.

Når pollenanalyse av fasekontrastmetoden også kan finjustere overflatestrukturer ved hjelp av pollenkorn blir synliggjort.

Videre er bildedannelsen i høyoppløselig overføringselektronmikroskopi og i høyoppløselig lysfelt- skanning overføringselektronmikroskopi basert på effekten av fasekontrast - men den av bølgefunksjonene til stråleelektronene.

Se også

litteratur

  • F. Zernike: Fasekontrastmetoden i mikroskopisk observasjon. I: Z. tekn. Fysikk. 16, 1935, s. 454-457.
  • A. Köhler, W. Loos: Fasekontrastmetoden og dens anvendelser i mikroskopi. I: Naturvitenskapene. Nr. 29, 1941, s. 49-61.
  • K. Michel: Representasjonen av kromosomer ved hjelp av fasekontrastmetoden. I: Naturvitenskapene. Nr. 29, 1941, s. 61-62.
  • K. Michel: fasekontrast. I: Zeiss kommunikasjon. Nr. 1, 1959, s. 243-267.
  • Heinz Gundlach: For 50 år siden: Nobelpris for Frits Zernike (1888–1966) i fysikk for utvikling av fasekontrastmetoden. I: Gjeldende cellebiologi. Volum 29, nr. 2, 2003, s. 15

weblenker