Vertico-SMI

Den Vertico-SMI er et fluorescens mikroskop for tre-dimensjonal avbildning av celler i nanometer (super oppløsning mikroskopi). I motsetning til sammenlignbare tilnærminger utføres markeringen med normale fluorescerende fargestoffer som GFP, Cy2 / 3, fluorescein, alexa og atto fargestoffer, basert på det såkalte blinkende fenomenet. Den er basert på to mikroskopteknologier som ble utviklet i 1996, lokaliseringsmikroskopi SPDM og strukturert belysning SMI. Den effektive optiske oppløsningen til dette optiske nanoskopet når 5 nm i 2D og 40 nm i 3D og er derfor betydelig bedre enn den fysiske oppløsningsgrensen på 200 nm, postulert av Abbes lov i 1873.

To-farget 3D superoppløsningsmikroskopi i farmasøytisk forskning: Nanoskopi med Her2 og Her3 i brystkreft, merket med Alexa 488, Alexa 568

konfigurasjon

"SMI" står for en spesiell type laseroptisk belysning ( Spatially Modulated Illumination , Spatially Structured Illumination) og "Vertico" for den vertikale oppstillingen av mikroskopaksen, som muliggjør faste celler så vel som levende celler med en tredimensjonal effektiv optisk oppløsning på 40  nanometer (1 nanometer = 1 nm = 10 -9  m) som skal analyseres.

Grunnleggende

Mikroskopet ble utviklet av Christoph Cremer , professor i anvendt optikk og informasjonsbehandling ved Heidelberg University / Institute for Molecular Biology . Den er basert på en kombinasjon av lysoptiske teknikker for lokaliseringsmikroskopi (SPDM, Spectral Precision Distance Microscopy ) og strukturert belysning (SMI, Spatially Modulated Illumination ). En spesiell funksjon i motsetning til fokuseringsteknikker som 4Pi-mikroskopi er vidvinkelbildene der hele prøven blir belyst og oppdaget samtidig. Dette gjør at hele celler kan tas opp raskt ved hjelp av nanoskopisk teknikk. For 3D-opptak av slike hele celler med typiske bildefelt med størrelse 20 µm × 20 µm, er det bare to minutter som trengs.

Den effektive optiske oppløsningen til dette optiske nanoskopet har nådd et område på 5 nm i 2D og 40 nm i 3D og er derfor betydelig under den fysiske grensen på 200 nm, som ble definert av Abbes lov i 1873 som den fysiske grensen under hvilken et lys mikroskopisk oppløsning er teoretisk ikke mulig postulert.

Romlig modulert belysning (SMI)

SMI + TIRF fra sykt humant øyevev for å undersøke makuladegenerasjon

Spatially Modulated Illumination (SMI) står for romlig strukturert belysning. SMI mikroskopi er en lys-optisk prosess kjent som punktspredefunksjon engineering. Disse skal forstås som metoder som endrer et spredningsfunksjon (PSF) til et mikroskop på en passende måte for enten å øke den optiske oppløsningen, presisjonen til avstandsmålinger på punktformet, dvs. dvs. å maksimere fluorescerende objekter som er små sammenlignet med bølgelengden eller å trekke ut andre strukturelle parametere i nanometerområdet.

Med SMI-mikroskopet som for øyeblikket utvikles ved Kirchhoff Institute for Physics ved Universitetet i Heidelberg, oppnås dette ved at eksiteringsintensiteten i objektrommet ikke er homogen, i motsetning til konvensjonelle fluorescerende mikroskop med bredt felt, men er romlig nøyaktig modulert i aksial retning ved å bruke to motstående, forstyrrende laserstråler blir. Prinsippet for det romlig modulerte bølgefeltet ble utviklet i 1993 av Bailey et al. utviklet. Med Heidelberg SMI-mikroskopi-tilnærming flyttes objektet gjennom bølgefeltet i trinn med høy presisjon, eller selve bølgefeltet forskyves (fase). Dette resulterer i en økning i aksialstørrelse og avstandsoppløsning.

SMI kan oppløsningsmikroskopiteknologier, for eksempel 3D LIMON eller LSI med andre Super TIRF som en total refleksjon, er (TIRF) interferometer med romlig strukturert belysning, kombinert. I kombinasjon med TIRF kan lysoptiske bilder av autofluorescerende (selvlysende) strukturer i menneskelig øyevev tas opp med en enestående optisk oppløsning ved hjelp av tre forskjellige eksitasjonsbølgelengder (488, 568 og 647 nm). Den optiske oppløsningen er 100 nm når man undersøker makuladegenerasjonen av sykt menneskelig øyevev.

Spektral presisjonsavstandsmikroskopi (SPDM)

SPDM (Spectral Precision Distance Microscopy) er en lysoptisk metode for fluorescensmikroskopi som gjør at posisjons-, avstands- og vinkelmålinger er mulige på "optisk isolerte" partikler (f.eks. Individuelle molekyler) langt under den optiske diffraksjonsgrensen . "Optisk isolert" betyr at bare et enkelt partikkel / molekyl på et bestemt tidspunkt blir registrert i et område definert av konvensjonell optisk oppløsning (typisk ca. 200–250 nm i diameter ). Dette er mulig hvis partiklene / molekylene som er lokalisert i et slikt område har forskjellige spektrale markeringer (f.eks. Har forskjellige farger eller viser andre nyttige forskjeller i lysutslipp).

Strukturoppløsningen mulig med SPDM kan indikeres med den minste målbare avstanden mellom to "punktformede" partikler med forskjellige spektrale markeringer bestemt i deres romlige posisjon ("topologisk oppløsning"). Simuleringsberegninger har vist at den "topologiske oppløsningen" tilsvarer en romlig frekvens som tilsvarer en sterkt økt optisk oppløsning i betydningen av den klassiske definisjonen under passende antagelser om lokaliseringsnøyaktighet, partikkeltetthet osv .

Det er en lokalisering mikroskopi, hvorved en effektiv optisk oppløsning er mulig, hvilket er mange ganger bedre enn den konvensjonelle optiske oppløsning (ca. 200 til 250 nm), gitt ved halv- bredden på hoved maksimum av effektiv punktspredefunksjonen . Ved å bruke egnede laseroptiske presisjonsmetoder måles posisjoner og avstander med nanometernøyaktighet mellom målobjekter med forskjellige spektralsignaturer som er betydelig mindre enn halvbredden til punktspredningsfunksjonen. Et viktig anvendelsesområde er genomforskning (studie av genomets funksjonelle organisering). Et annet viktig anvendelsesområde er membranstrukturforskning.

SPDMphymod “Blinkende fargestoffer” i stedet for fotoswitchable molekyler

Cremers arbeidsgruppe fant ut i 2008 at under visse fotofysiske forhold kan superoppløsningsmikroskopi også implementeres for mange “veldig vanlige” fargestoffmolekyler som GFP eller Alexa fargestoffer. Dette betyr at lysmolekyler kan brukes i samme spektrale farge (men med forskjellige spektrale signaturer på grunn av "blinkende" egenskaper). Ved å kombinere mange tusen enkeltbilder av samme celle, oppnås "lokaliseringsbilder" med betydelig forbedret optisk oppløsning ved hjelp av laseroptiske presisjonsmålinger.

Dette utvider anvendelsen av SPDM-metoden til mange områder innen biofysisk, cellebiologisk og medisinsk forskning.

  • Superoppløsningsmikroskopi - lokaliseringsmikroskopi

  • Lokaliseringsmikroskopi av enkelt blinkende YFP-molekyler / SPDMphymod

  • To-farges lokaliseringsmikroskopi SPDMphymod / Super Resolution-mikroskopi med GFP og RFP fusjonsproteiner

  • Markør / probe-fri lokaliseringsmikroskopi SPDM - tidligere usynlige cellestrukturer blir påvisbare

KALKE: 3D Super Resolution Microscopy

LIMON (Light MicrOscopical nanosizing microscopy) ble utviklet i 2001 ved Universitetet i Heidelberg og kombinerer de to metodene lokaliseringsmikroskopi og strukturert belysning for å lage 3D superoppløsningsmikroskopi.

Fremgangsmåten er som følger: Først blir det gjort SMI-opptak og deretter SPDM-prosessen. SMI-prosessen bestemmer sentrum for partiklene og deres forplantning i retning av den mikroskopiske aksen. Mens sentrum av partiklene / molekylene kan bestemmes med en nøyaktighet på 1–2 nm, kan forplantningen på dette punktet bestemmes opp til en aksial diameter på ca. 30–40 nm. Den laterale posisjonen til de enkelte partiklene / molekylene blir deretter bestemt med SPDM med en nøyaktighet på noen få nanometer. SPDM oppnår for øyeblikket 16 bilder per sekund (avhengig av kamera) med en effektiv oppløsning på 5 nm i 2D (objektplan); rundt 2000 er slike bilder kombinert med SMI-data for å oppnå et tredimensjonalt bilde av høyest mulig oppløsning (effektiv optisk 3D-oppløsning ca. 40–50 nm).

Ved å bruke denne tofargede kolokaliseringen 3D superoppløsningsmikroskopi, ble det romlige arrangementet av de to genene Her2 / neu og HER3 aktive i brystkreft bestemt med en nøyaktighet på ca. 25 nm, og deres klyngedannelse, som sannsynligvis er relevant for kreftutvikling ble analysert på enkeltmolekylnivå.

Biomolekylære maskiner, svært komplekse nanostrukturer som oppfyller grunnleggende funksjoner i kroppens celler, kan også undersøkes i deres biologisk relevante sammensetning med 3D Super Resolution Microscopy LIMON. Individuelle proteiner eller nukleinsyrer som er skjult i 3D-molekylære kompleks av såkalte biomolekylære maskiner, kan synliggjøres ved variabel markering uten å ødelegge komplekset.

Individuelle bevis

  1. ↑ a b Jürgen Reymann, David Baddeley, Manuel Gunkel, Paul Lemmer, Werner Stadter, Thibaud Jegou, Karsten Rippe, Christoph Cremer, Udo Birk: Høypresisjons strukturanalyse av subnukleære komplekser i faste og levende celler via romlig modulert belysning (SMI) mikroskopi . I: Kromosomforskning . teip 16 , nr. 3. mai 2008, s. 367-382 , doi : 10.1007 / s10577-008-1238-2 , PMID 18461478 .
  2. ↑ G Best, R Amberger, D Baddeley, T Ach, S Dithmar, R Heintzmann, C Cremer: strukturert belysning mikroskopi av autofluorescent samlinger i humant vev . I: Micron , 42, 2011, s. 330-335
  3. ↑ Manuel Gunkel, Fabian Erdel, Karsten Rippe, Paul Lemmer, Rainer Kaufmann, Christoph Hörmann, Roman Amberger, Christoph Cremer: Dual fargelokaliseringsmikroskopi av cellulære nanostrukturer . I: Biotechnology Journal . teip 4 , nr. 6 , 2009, ISSN  1860-6768 , s. 927-938 , doi : 10.1002 / biot.200900005 .
  4. ^ D Baddeley, C Batram, Y Weiland, C Cremer, UJ. Birk: Nanostrukturanalyse ved bruk av romlig modulert belysningsmikroskopi . I: Nature Protocols , 2007, 2:, s. 2640-2646
  5. ^ Rainer Kaufmann, Patrick Müller, Georg Hildenbrand, Michael Hausmann, Christoph Cremer: Analyse av Her2 / neu membranproteinklynger i forskjellige typer brystkreftceller ved bruk av lokaliseringsmikroskopi . I: Journal of Microscopy , 2010, doi: 10.1111 / j.1365-2818.2010.03436.x .

weblenker