Multisubstratreaksjon
En multisubstratreaksjon er en enzymatisk reaksjon med flere substrater . Behandlingen av multisubstratreaksjoner er en gren av enzymkinetikken .
kjennetegn
Enzymer fungerer normalt med flere underlag som blir omdannet til ett eller flere produkter. Implementeringen av bare ett substrat er unntaket, f.eks. B. Hydrolase- og isomerasereaksjoner . Likevel er den sentrale ligningen av enzymkinetikk, Michaelis-Menten-forholdet , strengt tatt knyttet til dette eksepsjonelle tilfellet.
Som en prototype av en enzymatisk omdannelse, skal reaksjonen av laktatdehydrogenase (LDH) diskuteres her, dvs. konvertering av pyruvat med NADH, H + til laktat og NAD + (overskrift i figur 1), hvorved pyruvat (B) og NADH, H + (A) rollen til de to (co-) substratene og laktat (Q) eller NAD + (P) spiller rollen til de to produktene.
Enzymkinetiske parametere (kalt Michaelis-konstanter eller Km-verdier) bestemmes som følger:
- Km-verdien for pyruvat oppnås ved å variere pyruvatkonsentrasjonen i nærvær av et stort overskudd (metningskonsentrasjon) av det andre substratet NADH, H + ;
- Km-verdien for NADH, H + bestemmes deretter ved å bestemme NADH, H + konsentrasjonen i nærvær av et mettende overskudd av pyruvat.
Et alternativ er å variere begge substrater, det vil si gradvis øke pyruvatkonsentrasjonen i nærvær av en annen, ikke-mettende konsentrasjon av NADH, H + . En slik prosedyre har den spesielle fordelen at den også gir informasjon om reaksjonsmekanismen. I del A av omsetningen av NADH + H + av LDH ved tre ikke-mettende konsentrasjoner av NADH, H + (A3> A2> A1) viser Lineweaver-Burk-diagrammet tilsynelatende mønsteret for ikke-konkurransedyktig inhibering. I det sekundære plottet i del B brukes aksesegmentene (diamanter) fra del A til å bestemme Km-verdien for det andre substratet (NADH, H + ).
Sekvensielle og ping-pong mekanismer
Laktatdehydrogenase fungerer i henhold til en "sekvensiell" mekanisme. Dette betyr at alle substrater må binde seg til enzymet før reaksjonen finner sted og produktene frigjøres. Siden to substrater (A og B) blir to produkter (P og Q), snakker en (i nomenklaturen til William Wallace Cleland ) om en "sekvensiell bi-bi" -mekanisme (fig. 2A). I tilfelle av en ordnet prosess ("obligatorisk rekkefølge"), er bindingen av det første substratet (A) nødvendig slik at enzymet kan danne bindingspunktet for det andre substratet (B), det vil si "blysubstratet" (NADH, H + ) må bli assosiert før det påfølgende substratet (pyruvat) kan binde seg. Følgelig må blyproduktet P (NAD + ) ha forlatt EPQ-komplekset før Q (laktat) kan skille seg fra EQ. Det er i utgangspunktet ingen komplekser av typen EAQ og EBP (substrat og partnerprodukt), og det er heller ikke komplekser som EP eller EB. I motsetning til dette assosieres / dissosieres alle substrater / produkter i tilfeldig ("tilfeldig ordre") mekanisme i hvilken som helst rekkefølge. Komplekser av typen EB og EP kan eksistere (ikke vist).
Andre enzymer, slik som aminosyre- naser imidlertid bruke en “ping-pong-bi-bi” mekanisme hvor to substrater (BI) er også omdannet til to produkter (BI), om enn i separate reaksjonstrinn. Transaminaser omdanner substratet A (aminosyre 1) til et produkt P (alfa-ketosyre 1) (ping). En annen alfa-ketosyre (B) tas deretter opp og den analoge aminosyren overføres (Pong). Denne mekanismen fungerer fordi den protetiske gruppen av enzymet (pyridoksal fosfat) blir pyridoksaminfosfat mellom reaksjonene. Man snakker om overgangen fra enzymformen "E" til enzymformen "F". På slutten av syklusen gjenopprettes den opprinnelige tilstanden. I den tilfeldige ping-pong-mekanismen frigjøres produktet etter binding av det første substratmolekylet (ping). E skifter til en annen enzymform (F), med hvilket det andre substratet reagerer og danner det andre produktet (Pong).
En analyse som vist i figur 1 kan brukes til å skille mellom de to reaksjonstypene:
- omsetningshastigheten til pyruvat (B) undersøkes i nærvær av forskjellige (umettede) konsentrasjoner av NADH, H + (A). Bare de enzymmolekylene som allerede har bundet NADH, H +, kan også binde pyruvat (B) og utføre reaksjonen. Maksimal responshastighet, Vmax, kan ikke oppnås. Imidlertid gir de enzymmolekylene som er til stede som kompleks EAB de forventede Michaelis-konstantene (Km) for A og B;
- når det gjelder et enzym i henhold til ping-pong-mekanismen, vil en familie av parallelle rette linjer bli oppnådd i figur 1A (ikke vist).
Siden sekvensielle enzymer er utbredt, mens bordtennis-enzymer er mindre vanlige, vil bare egenskapene til den første gruppen bli diskutert her.
Sekvensielle mekanismer: ordnet eller vilkårlig?
De tre grunnleggende reglene:
- Ved bruk av LDH ble den obligatoriske tilknytningen av "blysubstrat" A (NADH, H +) foran "påfølgende substrat" B (pyruvat) beskrevet. Som et resultat kan enzymet være til stede som EA- og EAB-kompleks, men ikke som komplekst EB ( regel 1 ).
- Tilsvarende må "blyproduktet" P (NAD + ) forlate enzymet før "sekundærproduktet" Q (laktat), det vil si at et EP-kompleks ikke kan eksistere, men et EPQ- eller EQ-kompleks kan ( regel 2 ).
- Videre er det ingen "blandede former" av EAQ og EBP der et substrat og et produkt kombineres ( regel 3 ).
Hvis man nå utfører enzymkinetiske analyser analogt med fig. 1, men i nærvær av et stort overskudd av et av produktene (P eller Q), kan den ordnede sekvensen også bevises, nemlig ved at den maksimale reaksjonshastigheten i nærvær av produktet (NAD + ) oppnås ikke (fig. 3, situasjon II). Med den vilkårlige mekanismen ville det imidlertid oppnås (figur 3 situasjon VI). Følgende oppsett er dedikert til de mulige variasjonene av et slikt eksperiment i detalj:
Figur 3 viser forskjellige kinetikker i nærvær av et produktoverskudd for å skille mellom ordnet (´obligatorisk rekkefølge´) og vilkårlig (´andom ordre´) reaksjonsmekanisme. Store bokstaver angir produkter i overkant, en kile er et substrat, hvis konsentrasjon er variert
Variant I: A og B møter E; P kan bare koble til EQ (regel 2), som innebærer konvertering av B. Økende [A] akselererer dannelse av EPQ; Vmax nås ikke fordi EPQ-dissosiasjon hindres av P (mønster: " ikke-konkurransedyktig ")
Variant II: A og B møter E. P kan bare kombineres med EQ, som krever konvertering av B. Økende [B] akselererer EPQ-dannelse; Vmax nås ikke fordi EPQ-dissosiasjon hindres av P (mønster: " ikke-konkurransedyktig ")
Variant III: A og B oppfyller EQ. Siden det ikke er noe EAQ-kompleks (regel 3), konkurrerer A med Q: økende [A] fører til forskyvning av den forstyrrende naboen, hvorved Vmax blir nådd, men Km øker på grunn av konkurransen (mønster: " konkurransedyktig ")
Variant IV: A og B møter EQ. Økende [B] kan ikke forskyve Q, siden B bare kunne binde seg til EA (regel 1). Vmax kan ikke oppnås fordi bindingsstedet for A bare kan være delvis mettet (mønster: " ikke-konkurransedyktig ")
Variant V: A og B møter EP. Økende [A] er i stand til å forskyve produktet som ligger på samme bindingssted, slik at Vmax nås (mønster: " konkurransedyktig ")
Variant VI: A og B møter EP. Økende B fortrenger P fra det nærliggende bindingsstedet, siden EPB ikke kan eksistere (regel 3). Vmax oppnås fordi dissosiasjon av Q fra EPQ ikke hindres av P (mønster: " konkurransedyktig ")
litteratur
- WW Cleland: Kinetikken til enzymkatalyserte reaksjoner med to eller flere substrater eller produkter . I: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Spesialisert seksjon om enzymatiske emner . teip 67 , 1963, s. 104-137 , doi : 10.1016 / 0926-6569 (63) 90211-6 .
- H. Bisswanger: Enzymkinetikk : teori og metoder . 2. rediger igjen Utgave. VCH, Weinheim [u. a.] 1994, ISBN 3-527-30032-5 , kapittel 2.6: Multi-substrat reaksjon .
- Donald Voet, Judith G Voet, Charlotte W Pratt: Lærebok for biokjemi [med CD-ROM] . Red.: Annette G. Beck-Sickinger, Ulrich Hahn. 2., handle. og eksp. Utgave. Wiley-VCH, Weinheim 2002, ISBN 3-527-30519-X , kapittel 12: enzymkinetikk .