Interferensrefleksjonsmikroskopi

Interferensrefleksjonsmikroskopi (også: refleksjonskontrastmikroskopi ) er en lysmikroskopisk metode som meget tynne strukturer kan undersøkes med. Den er basert på dannelsen av forstyrrelser som oppstår når lys reflekteres ved strukturens øvre og nedre grensesnitt og reflektert lys fra begge grensesnittene forstyrrer hverandre. Dette skaper interferensmønstre som kan observeres og gir informasjon om tykkelsen på strukturen.

De resulterende interferensfargene eller interferenslinjene tillater tykkelsesmålinger i området under 200 nanometer, dvs. under den normale oppløsningen til lysmikroskopet. De resulterende interferenslinjene tilsvarer i løpet av konturlinjene på et kart, forutsatt at brytningsindeksen forblir konstant i objektet. Siden interferensmønstrene blir observert gjennom et lysmikroskop, kan disse tykkelsesmålingene tildeles mikroskopisk gjenkjennelige strukturer, for eksempel individuelle utvidelser av celler . For nøyaktige målinger av den regionale lagtykkelsen eller endringer i lagtykkelsen, bør monokromatisk lys brukes fordi bølgelengden til det lysende lyset er inkludert i beregningen. Jo kortere bølgelengde, jo finere er den vertikale oppløsningen. Hvis for eksempel monokromatisk grønt lys brukes (bølgelengde: 546 nm), kan tykkelsesmålinger utføres i røde blodlegemer (erytrocytter) med en oppløsning på 113 nm. I likhet med intern totalrefleksjonsfluorescensmikroskopi (TIRF) er observasjon begrenset til gjenstander på prøveoverflaten, dvs. nær dekkglasset .

Prosessen har fått forskjellige navn av forskjellige forfattere. Det eldste navnet (1964) er Interference Reflection Microscopy (IRM), i tysk interferensrefleksjonsmikroskopi. Andre navn er Reflection Contrast Microscopy (RCM; 1975), på tysk Reflection Contrast Microscopy , og Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM, 1981). En engelsk oversiktsartikkel fra 2000 lister også: interferens kontrast, interferens refleksjon kontrast, refleksjon interferens kontrast, overflaterefleksjons interferens og overflatekontrast mikroskopi .

Historie og bruksområder

Teknikken ble først brukt i 1958 og 1960 for å studere tynne lag og introdusert i cellebiologi i 1964 . Mer arbeid ble ikke publisert før omtrent ti år senere. På 1970-tallet ble teknologien videreutviklet og tilbudt kommersielt av Ernst Leitz og Carl Zeiss . Leitz har markedsført prosessen under navnet "Reflection Contrast", Zeiss under navnet "Immersion Contrast". Hovedforskjellen mellom de to variantene var innfallsvinkelen til det lysende lyset. På Leitz ble gjenstanden belyst i et konsentrisk innfallende skrått lys (innfallsvinkel: 45 °), ved Zeiss ortogonalt (innfallsvinkel 0 °). Innfallsvinkelen har optiske og fysiske effekter på dannelsen av bildet, og det er derfor begge metodene ikke er å anse som ekvivalente. Metoden ble ikke allment akseptert; det var en samling publikasjoner for spesielle applikasjoner på 1970- og 1980-tallet.

Ved å bruke polarisasjonsfiltre i strålebanen (helst i en kryssposisjon ) og en λ / 4-plate i linsen (antifleks linse), blir lys som reflekteres på glassflater i selve linsen filtrert ut. Bare lyset som reflekteres fra objektet bidrar til skapelsen av bildet. Hvis polarisasjonsfiltrene er ordnet i en kryssposisjon, lyser gjenstandene sterkt på svart bakgrunn. Tilbehør til andre spesielle prosesser, for eksempel fluorescensmikroskopi eller differensiell interferenskontrast , kan også festes til det samme mikroskopet , slik at disse teknikkene kan kombineres. Leitz refleksjonskontrastlinser ble utstyrt med faseringe som standard, slik at en sømløs endring mellom refleksjonskontrast og fasekontrast kunne gjøres, og et fasekontrastbilde kunne også legges til om nødvendig.

Interferensrefleksjonsmikroskopi har blitt brukt spesielt ofte for undersøkelse av celleadhesjon til glass og bestemmelse av tykkelsen på celleforlengelser ( pseudopodia ). Fokuspunkter for vedheft ble først beskrevet ved hjelp av denne teknikken i 1976. Andre anvendelser var rekonstruksjon av overflatelindring av erytrocytter og undersøkelse av retikulocytter i blodutstryk, siden disse kan skilles fra modne røde blodlegemer ( erytrocytter ) i denne prosedyren , samt undersøkelser av kromosompreparater og cytoskelettet i faste celler. Siden 2004 har IRM opplevd en slags renessanse med utviklingen av iSCAT-mikroskopet .

Funksjonelt prinsipp ved bruk av eksempel på celleheft

Skjematisk fremstilling av interferensrefleksjonsmikroskopi. To lysstråler (tykkere grønne bølgede linjer) kommer nedenfra gjennom et dekkglass (grått) og treffer enten en celle (brun) eller først på vandig cellekulturmedium (okkergul) og deretter på cellen. Der lysstrålen fra dekkglasset passerer direkte inn i cellen (venstre side) er det refleksjon (tynn grønn stråle). Hvis det derimot er et lite mellomrom mellom cellen og dekkglasset (høyre side), oppstår det en refleksjon ved dekkglassmediumgrensen og en annen ved mellomcellegrensen. De to resulterende bjelkene kan forstyrre hverandre. Den brytning av lys ved grensesnitt ble ignorert her.

Interferensrefleksjonsmikroskopi er basert på innfallende lysbelysning , refleksjon og interferens. Til kontrast -reduserende refleksjoner for å minimalisere på glassoverflater, er oljeimmersjon med ekkofrie linser som benyttes. En sentral membran i lysstrålebanen blokkerer også refleksjoner fra det sentrale området av linsen, der disse er spesielt urovekkende. Av praktiske årsaker brukes et invertert (invertert) mikroskop i cellebiologiske applikasjoner slik at cellene er på et dekkglass og kan observeres nedenfra.

I innfallende lys er bildet av en gjennomsiktig gjenstand forårsaket av refleksjonen av lyset ved grensesnitt der brytningsindeksen endres. Intensiteten til det reflekterte lyset er jo større jo større er forskjellen i brytningsindeksen. Nedsenkingsolje og glass har en veldig lignende brytningsindeks. I tilfelle av et preparat med levende celler som vokser på et dekkglass og blir belyst med innfallende lys (i det inverterte mikroskopet nedenfra) under nedsenking av olje, oppstår den første forskjellen i brytningsindeks ved overgangen fra dekkglass til det vandige mediet der cellene befinner seg. Dette skaper en relativt sterk refleksjon. Imidlertid, hvis det er en celle på det tidspunktet, er forskjellen i brytningsindeks, her mellom dekkglasset og cellen eller cellemembranen , betydelig mindre, og refleksjonen er tilsvarende svakere.

Hvis det fremdeles er et mellomrom fylt mellomrom mellom cellen og dekkglasset, kan dens tykkelse undersøkes ved hjelp av interferensrefleksjonsmikroskopi: Refleksjon skjer først ved dekkglassmediumovergangen og deretter ved mellomcelleovergangen. Hvis avstanden mellom disse to overgangene er i størrelsesorden bølgelengden til lyset som brukes, kan de to reflekterte strålene forstyrre hverandre. Når du bruker monokromatisk lys som bare inneholder en eller få bølgelengder, opprettes lyse og mørke områder. I kontrast skaper hvitt lys fargede områder, avhengig av hvilke bølgelengder som forstyrrer negativt eller positivt. Informasjon om avstanden mellom cellen og dekkglasset kan derfor leses fra disse observasjonene, nemlig i størrelsesorden som er under den vanlige oppløsningsgrensen for et lysmikroskop (≈ 200 nanometer ).

Den beskrevne effekten kan imidlertid forstyrres betydelig av reflekterte stråler som oppstår ved andre grensesnitt, for eksempel i tilfelle flatcelleprosesser fra overgangen av den bakre cellemembranen til det omgivende medium. Dette problemet reduseres hvis belysningen utføres med høy numerisk blenderåpning og cellen er minst ett mikrometer tykk, siden den øvre cellemembranen da ikke lenger kan bidra til interferensmønsteret på grunn av de optiske forholdene. Kvantitative undersøkelser kan deretter utføres under hensyntagen til celletykkelsen . Oftere ble det imidlertid utført kvalitative studier, for eksempel på fordelingen av knutepunktene for vedheft .

weblenker

Individuelle bevis

  1. ↑ a b W. J. Patzelt: Refleksjonskontrast, en ny mikroskopisk metode . I: Naturvitenskap . 63, nr. 11, november 1976, s. 535. doi : 10.1007 / BF00596860 . PMID 1004619 .
  2. ↑ a b c d H. Verschueren: Interferensrefleksjonsmikroskopi i cellebiologi: metodikk og applikasjoner . I: J. Cell. Sci. . 75, april 1985, s. 279-301. PMID 3900106 .
  3. ^ R. Parthasarathy, JT Groves: Optiske teknikker for avbildning av membrantopografi . I: Cell Biochem. Biophys. . 41, nr. 3, 2004, s. 391-414. doi : 10.1385 / CBB: 41: 3: 391 . PMID 15509889 .
  4. ^ TJ Filler, ET Peuker: Refleksjonskontrastmikroskopi (RCM): en glemt teknikk? . I: J Pathol . 190, nr. 5, april 2000, s. 635-638. doi : 10.1002 / (SICI) 1096-9896 (200004) 190: 5 <635 :: AID-PATH571> 3.0.CO; 2-E . PMID 10727991 .