Omvendt transkriptase polymerasekjedereaksjon

Den revers transkriptase polymerasekjedereaksjon ( revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon , RT-PCR for kort ) er kombinasjonen av to metoder for molekylær biologi - bruk av revers transkriptase (RT) og polymerase kjedereaksjon (PCR) - for å påvise RNA slike som B. genuttrykk av spesifikke gener i celler , vev og blodserum eller ribozymer , ribonukleoproteiner eller genomet til RNA-virus . RT-PCR brukes i forskning og diagnostikk .

Forkortelsen RT-PCR refererer noen ganger også til Real Time Quantitative PCR , noe som kan føre til forvirring, og det er derfor det oftere blir forkortet til qPCR . En kombinasjon av RT-PCR og qPCR blir da referert til som RT-qPCR.

historie

Omvendte transkriptaser ble oppdaget samtidig i 1970 av Howard M. Temin i Rous sarcoma virus (RSV) og av David Baltimore i RSV og Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV). For oppdagelsen mottok de begge 1975 Nobelprisen i fysiologi eller medisin , sammen med Renato Dulbecco . Generasjonen av cDNA fra RNA ved bruk av revers transkriptaser ble først beskrevet i 1971. Den påfølgende amplifiseringen av det genererte cDNA fant sted for første gang i 1976 ved bruk av DNA-polymeraser. Bruken av termostabile DNA-polymeraser fant sted for første gang i 1989. I 1990 ble en RT-PCR utført for første gang i en reaksjonsblanding ( ett-trinns RT-PCR ). Den spesifisiteten av reaksjonen kunne økes ved anvendelse av varm-start-DNA-polymeraser .

prinsipp

RT-PCR er vanligvis en tretrinnsprosess: Etter RNA-rensing transkriberes RNA til DNA, deretter blir deler av DNA spesifikt amplifisert. For å oppdage transkripsjon av et gen, transkriptomet , et ribozym, ribonukleoproteiner eller genomet av RNA-virus, må RNA undersøkes. Derfor brukes først en omvendt transkriptase (RT), en RNA-avhengig DNA-polymerase, ved hjelp av hvilken RNA kan transkriberes til cDNA . I en påfølgende amplifikasjon av DNA ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen (PCR), brukes spesifikke termostabile DNA-polymeraser som er DNA-avhengige, dvs. det vil si at de ikke klarer å forsterke RNA. CDNA kan deretter brukes som utgangsmateriale i en PCR for å amplifisere spesifikke sekvenser fra den. Oftest brukes en ti-minutters oppvarming til 95 ° C mellom revers transkripsjon og PCR, hvor revers transkriptase er denaturert . Produktene fra RT-PCR kan undersøkes ved gelelektroforese og deretter klones eller sekvenseres .

Den reverse transkriptaser som brukes i dag er modifiserte enzym-varianter fra forskjellige retrovirus , slik som de av Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV) eller den Avian myeloblastosevirus (AMV). De forskjellige variantene av enzymet er modifisert avhengig av produsent på en slik måte at de kan generere en høyere spesifisitet eller bedre utbytter, for eksempel blir RNase H- aktiviteten som naturlig forekommer i enzymet slettet. Konvensjonelle revers transkriptaser av retroviral opprinnelse brukt til RT-PCR , slik som AMV og MoMuLV revers transkriptase, er ikke termostabile ved 95 ° C. Ved de lavere temperaturene for omvendt transkripsjon med disse enzymene forekommer imidlertid uspesifikke bindinger av primere til DNA-malen og sekundære strukturer i DNA-malen, noe som kan føre til uønskede produkter og forhindre syntese av riktig produkt. Imidlertid kan AMV revers transkriptase brukes opp til 70 ° C. For revers transkriptase av MoMuLV er mer termostabile RNaseH-negative mutanter blitt beskrevet (mutasjoner E69K, E302R, W313F, L435G, N454K). Videre ble malspesifisiteten til termostabile DNA-polymeraser redusert ved å bytte kofaktor (divalente magnesiumioner) mot divalente mangansalter , slik at med en DNA-avhengig termostabil polymerase, kunne RNA også brukes i en RT-PCR som en mal for syntese av DNA. Siden syntesesatsen for Taq- polymerase med manganioner var relativt lav, ble Tth- polymerasen i økende grad brukt i denne varianten av RT-PCR . Tilsetningen av manganioner økte imidlertid også antallet defekte produkter og økte mengden mal-DNA som kreves, og det er derfor disse enzymene sjelden brukes til revers transkripsjon i dag. Disse problemene kunne unngås med den termostabile 3173- polymerasen fra termofile bakteriofager , som tåler de høye temperaturene til en PCR i lang tid og foretrekker RNA som en mal.

Som en RNA-avhengig DNA-polymerase krever revers transkriptase et kort stykke DNA, en såkalt primer , for å starte syntese av komplementært DNA (cDNA). For å analysere mRNA som bærer poly-A , er en såkalt oligo-d (T) primer anvendt her, dvs. flere tymin baser som er komplementære til poly (A) halen ved 3'-enden av den mRNA .

Svært korte RNA-molekyler som modne mikroRNAer er altfor små (17–22 baser) for bruk av konvensjonelle primere. Derfor, for omvendt transkripsjon av disse nukleinsyrene, brukes spesielle sløyfeprimere, som bare hybridiserer med mindre enn 10 baser i 3. ende og dermed selektivt avgrenser modne microRNA (i stedet for mRNA).

Gen- spesifikke primere brukes bare i det andre trinnet av RT-PCR . I en modifisert variant brukes One-Step RT-PCR , genspesifikke primere i stedet, og begge reaksjonene utføres etter hverandre i samme kar. Med Zero-Step RT-PCR er det heller ikke noe isotermisk mellomsteg som ellers utføres under revers transkripsjon og før PCR-reaksjonen. På grunn av den høye termiske stabiliteten til det bioteknologisk modifiserte enzymet, kan begge reaksjonene finne sted parallelt i samme kar. Samtidig brytes sekundære strukturer av RNA permanent opp på grunn av den høyere temperaturen på over 55 ° C. En annen variant av RT-PCR er RACE-PCR .

applikasjoner

Siden et cDNA er komplementært til det opprinnelige mRNA, kan aminosyresekvensen til et protein som denne mRNA- koden også være avledet fra den genetiske koden . Siden et mRNA i eukaryoter allerede er modifisert og spleiset etter transkripsjonen , er det i motsetning til genet også intronfritt . I tillegg muliggjør dette cDNA også informasjon om hvorvidt det assosierte genet uttrykkes i forskjellige isoformer , dvs. dvs. mRNA er alternativt spleiset . RT-PCR kan derfor brukes til spesifikt å oppdage genuttrykk. RT-PCR brukes også til diagnostisering av RNA-virus i blodserum, som HIV og, mer nylig, ofte i forbindelse med influensa A / H5N1 og SARS-CoV-2 .

I tilfelle av en Northern blot kan hybridiseringsprobene produseres ved RT-PCR. For å analysere transkriptomet blir hele RNA transkribert til cDNA og kopiert i en RT-PCR med en blanding av korte primere (engelske tilfeldige heksamerer ). Dette blir vanligvis etterfulgt av en mikroarray eller sekvensering av cDNAene. Her er bestemmelsen av Expressed Sequence Tags (EST) ofte tilstrekkelig til å identifisere transkripsjonene.

litteratur

Individuelle bevis

  1. Tem HM Temin, S. Mizutani: RNA-avhengig DNA-polymerase i virioner av Rous sarkomvirus. I: Nature (1970), bind 226 (5252), s. 1211-3. Erratum i: Natur. 1970 227 (5253): 102. PMID 4316301 .
  2. ↑ Baltimore D: RNA-avhengig DNA-polymerase i virioner av RNA-tumorvirus . I: Natur . 226, nr. 5252, juni 1970, s. 1209-11. doi : 10.1038 / 2261209a0 . PMID 4316300 .
  3. ^ S. Spiegelman , KF Watson, DL Kacian: Syntese av DNA utfyller naturlige RNA: en generell tilnærming. I: Proc Natl Acad Sci U.S.A. (1971), bind 68 (11), s. 2843-5. PMID 4330945 ; PMC 389539 (fri fulltekst).
  4. ↑ A. Efstratiadis, FC Kafatos, AM Maxam, T. Maniatis : Enzymatisk syntese in vitro av globin-gener. I: Cell (1976), bind 7 (2), s. 279-88. PMID 60178 .
  5. ↑ a b A. M. Carothers, G. Urlaub, J. Mucha, D. Grunberger, LA Chasin: Punktmutasjonsanalyse i et pattedyrgen: rask fremstilling av total RNA, PCR-amplifikasjon av cDNA og Taq-sekvensering ved en ny metode. I: Biotechniques (1989), bind 7 (5), s. 494-6, 498-9. PMID 2483818 .
  6. ↑ AL Shaffer, W. Wojnar, W. Nelson: Amplification, deteksjon og automatisk sekvensering av gibbon interleukin-2-mRNA ved hjelp av Thermus aquaticus DNA-polymerase revers transkripsjon og polymerase kjedereaksjon. I: Anal Biochem. (1990), bind 190 (2), s. 292-6. PMID 2291473 .
  7. ↑ LN Sellner, RJ Coelen, JS Mackenzie: Omvendt transkriptase hemmer Taq-polymeraseaktivitet. I: Nucleic Acids Res. (1992), bind 20 (7), s. 1487-90. PMID 1374554 ; PMC 312227 (gratis fulltekst).
  8. ↑ MJ Roth, N. Tanese, SP Goff: Rensing og karakterisering av murin retroviral revers transkriptase uttrykt i Escherichia coli. I: Journal of Biological Chemistry . Vol. 260, nummer 16, august 1985, s. 9326-9335, PMID 2410413 .
  9. ↑ F. Mallet, G. Oriol, C. Mary B. Verrier, B. Mandrand: Kontinuerlig RT-PCR ved bruk av AMV-RT og Taq DNA-polymerase: karakterisering og sammenlignet med koblede prosedyrer. I: BioTechniques. Volum 18, nummer 4, april 1995, s. 678-687, PMID 7541215 .
  10. ↑ A. Telesnitsky, SP Goff: RNase H domene mutasjoner påvirke interaksjonen mellom Moloney murin leukemivirus revers transkriptase og dens primer-templat. I: Proceedings of the National Academy of Sciences . Volum 90, nummer 4, februar 1993, s. 1276-1280, PMID 7679498 , PMC 45855 (fri fulltekst).
  11. ↑ L. Lu, T. Nakano, GA Smallwood, TG Heffron, BH Robertson, CH Hagedorn: En raffinert lang RT-PCR-teknikk for å amplifisere blir fullstendige virus-RNA-genomsekvenser i kliniske prøver: påføring på en ny hepatitt C-virusvariant av genotype 6 . In: Journal of virologiske metoder. Volum 126, nummer 1-2, juni 2005, s. 139-148, doi : 10.1016 / j.jviromet.2005.01.031 , PMID 15847930 .
  12. ↑ B. Fuchs, K. Zhang, MG Rock, ME Bolander, G. Sarkar: Høy temperatur cDNA-syntese ved hjelp av AMV revers transkriptase forbedrer spesifisiteten av PCR. I: Molekylær bioteknologi. Volum 12, nummer 3, oktober 1999, s. 237-240, doi : 10.1385 / MB: 12: 3: 237 , PMID 10631680 .
  13. ↑ B. Arezi, M. McCarthy, H. Hogrefe: Mutant av Moloney murin leukemivirus revers transkriptase oppviser større motstandsdyktighet mot vanlige RT-qPCR-inhibitorer. I: Analytisk biokjemi. Volum 400, nummer 2, mai 2010, s. 301-303, doi : 10.1016 / j.ab.2010.01.024 , PMID 20100452 .
  14. My TW Myers, DH Gelfand: Omvendt transkripsjon og DNA-amplifikasjon av en Thermus thermophilus DNA-polymerase. I: Biochemistry (1991), Vol. 30 (31), s. 7661-6. PMID 1714296 .
  15. J MJ Moser, RA DiFrancesco, K. Gowda, AJ Klingele, DR Sugar, S. Stocki, DA Mead, TW Schoenfeld: Termostabil DNA-polymerase fra et viralt metagenom er et kraftig RT-PCR-enzym. I: PLoS One (2012), bind 7 (6), s. E38371. doi : 10.1371 / journal.pone.0038371 . PMID 22675552 ; PMC 3366922 (gratis fulltekst).