Fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi

Fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM, tysk lokaliseringsmikroskopi etter fotoaktivering eller fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi ) og stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM) er spesielle metoder for lysmikroskopi , nærmere bestemt fluorescensmikroskopi . De er basert på en lysstyrt inn- og utkobling av fluorescens i individuelle molekyler. Slå på og av skjer over en viss tidsperiode, der flere enkeltbilder kan tas opp. En påfølgende datamaskinberegning gjør det mulig å bestemme posisjonen til individuelle molekyler med en oppløsning utenfor denoptiske oppløsningsgrensen beskrevetav Ernst Abbe .

historie

Teknologien ble utviklet parallelt av tre grupper i 2006 og fikk forskjellige navn. Eric Betzig og kollegaer ved Howard Hughes Medical Institute kalte det PALM, ST Hess og kolleger ved FPALM og Xiaowei Zhuang og kolleger ved Harvard University kalte det STORM. Oppløsningen som ble oppnådd ble gitt som 2 til 25 nm eller 20 nm. Det er nå mulig å bruke denne teknikken til å spore individuelle enzymmolekyler i individuelle bakterier under arbeidet.

Arbeidsprinsipp

I klassisk fluorescensmikroskopi kan ikke fluorescerende molekyler som er for nær hverandre løses lenger: De ser ut som en enkelt struktur.

PALM omgår dette problemet med de spesielle egenskapene til fotoaktiverbare fluorescerende proteiner (engelsk: photoactivatable fluorescerende proteiner PA-FPs) bruker. Disse spesielle variantene av det grønne fluorescerende proteinet (GFP) kan aktiveres og deaktiveres på en målrettet måte med lys av en viss bølgelengde og intensitet. Som andre GFP-er, kan de smeltes molekylært til proteiner hvis posisjon i cellen skal undersøkes.

Først og fremst er alle PA-FP-er inaktive, dvs. ikke fluorescerende. Et kort lysglimt med en passende bølgelengde aktiverer noen få PA-FPs tilfeldig. Denne byttingen er i stor grad ikke-lineær, siden molekyler bare kan aktiveres eller ikke aktiveres. Etterpå kan de bli begeistret for fluorescens med lys av en "avhør bølgelengde", og de emitterte fluorescensfotonene kan oppdages. Etter hvert som eksponeringen utvikler seg, blekner disse fluorescerende molekylene, det vil si at evnen til å fluorescere går tapt i dette molekylet. Flere bilder tas kontinuerlig. Testbetingelsene velges på en slik måte at sannsynligheten for at to molekyler som ligger nær hverandre aktiveres samtidig i tilfelle en aktiveringsblits forblir veldig liten. Siden fluorescerende molekyler som er for tett sammen ikke kan skilles fra hverandre, er dette en forutsetning for høy oppløsning i nanometerområdet.

Nok et lysglimt aktiverer tilfeldigvis andre PA-FP-er, og prosessen gjentas. Etter mange runder blir alle PA-FP-er registrert en gang. Du kan ta opp til alle PA-FPs til slutt blekes. I stedet for å bruke individuelle aktiveringsblinker, kan preparatet også belyses kontinuerlig med aktiveringslyset. Lysstyrken som er brukt er så lav at bare individuelle - tilfeldig distribuerte - PA-FP-er aktiveres.

De fluorescerende molekylene virker opprinnelig uskarpe på grunn av diffraksjonen av mikroskopet. Imidlertid kan den nøyaktige posisjonen til hvert molekyl beregnes ved hjelp av en matematisk algoritme ved hjelp av punktspredningsfunksjonen . Ideen er basert på det faktum at hvert molekylære bilde ble spilt inn romlig isolert, og dets posisjon kan derfor bestemmes med en høyere oppløsning, for eksempel som tyngdepunktet for det oppnådde lyspunktet. Dette fungerer imidlertid bare hvis tilstøtende molekyler ikke er aktive samtidig. Et dataprogram bestemmer deretter posisjonene til molekylene som er aktive der for alle delbilder og genererer det endelige bildet av dette.

Prinsippet om lokaliseringsmikroskopi med høy oppløsning er ikke begrenset til fluorescerende, byttbare proteiner. Blinkende fargestoffer, som har en langvarig mørk tilstand, kan også brukes.

Ikke-byttbare, fluorescerende proteiner ( GFP ) kan også få blink til og dermed brukes til høyoppløselig mikroskopi.

Eiendommer, distribusjon og alternativer

En fordel er den relativt enkle strukturen til mikroskopet. Siden optikken som brukes hovedsakelig består av normale mikroskopdeler, er bruk av et klassisk fluorescensmikroskop med et raskt kamera i prinsippet mulig for PALM.

Andre muligheter i lysmikroskopi for å oppnå en veldig høy oppløsning inkluderer STED-mikroskopi og nærfeltmikroskopi ( TIRF og SNOM ).

weblenker

Individuelle bevis

  1. ↑ Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess: Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution . I: Vitenskap . Vol. 313, nr. 5793 , september 2006, s. 1642-1645 , doi : 10.1126 / science.1127344 .
  2. ^ Samuel T. Hess, Thanu PK Girirajan, Michael D. Mason: Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy . I: Biophysical Journal . teip 91 , nr. 11 , 2006, s. 4258-4272 , doi : 10.1529 / biophysj.106.091116 .
  3. ↑ Michael J. Rust, Mark Bates, Xiaowei Zhuang: Sub-diffraksjons-grense bildedannelse ved hjelp av stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) . I: Naturmetoder . teip 3 , 2006, s. 793-796 , doi : 10.1038 / nmeth929 .
  4. ↑ S. Uphoff, R. Reyes-Lamothe et al.: Single-molekyl DNA-reparasjon i levende bakterier. I: Proceedings of the National Academy of Sciences . Volum 110, nummer 20, mai 2013, ISSN  1091-6490 , s. 8063-8068, doi: 10.1073 / pnas.1301804110 , PMID 23630273 , PMC 3657774 (fri fulltekst).
  5. ↑ Alexander Egner, Claudia Geisler, Claas von Middendorff, Hannes Bock, Dirk Wenzel, Rebecca Medda, Martin Andresen, Andre C. Stiel, Stefan Jakobs, Christian Eggeling, Andreas Schönle, Stefan W. Hell: Fluorescence Nanoscopy in Whole Cells by Asynchronous Localization av Photoswitching Emitters . I: Biophysical Journal . Vol. 93, november 2007, s. 3285-3290 , doi : 10.1529 / biophysj.107.112201 .
  6. ↑ Jonas Fölling, Mariano Bossi, Hannes Bock, Rebecca Medda, Christian A. Wurm, Birka Hein, Stefan Jakobs, Christian Eggeling, Stefan W. Hell: Fluorescens nanoskopi ved grunntilstandsutarmning og retur av enkeltmolekyler . I: Naturmetoder . Vol. 5, nr. 11 , 2008, s. 943-945 , doi : 10.1038 / nmeth.1257 .
  7. ↑ Manuel Gunkel, Fabian Erdel, Karsten Rippe, Paul Lemmer, Rainer Kaufmann, Christoph Hörmann, Roman Amberger, Christoph Cremer : Dual fargelokaliseringsmikroskopi av cellulære nanostrukturer. I: Biotechnology Journal. Bind 4, nr. 6, juni 2009, ISSN  1860-6768 , s. 927-938, doi: 10.1002 / biot.200900005 .