Kloning

Kloning (eller kloning , engelsk molekylær kloning ) er paraplybegrepet i molekylærbiologi for metoder for å oppnå og identisk duplisering av deoksyribonukleinsyre (DNA). I motsetning til kloning , som har som mål å produsere genetisk identiske organismer, er kloning begrenset til å produsere identiske DNA- molekyler .

eiendommer

Under kloning integreres et ønsket DNA- fragment (for eksempel et gen eller cDNA som koder for et protein ) i en vektor (for eksempel et plasmid eller en virusvektor ). Målet med kloning er å multiplisere et DNA-fragment for å undersøke dets egenskaper eller bruke det i videre prosesser. Etter replikering tillater isolering av plasmid-DNAet et multiplum av mengden DNA som opprinnelig ble brukt, som, i motsetning til in vitro- metoder som PCR, er billig, presis og i stort antall. Alternativt kan cellene være et genprodukt , slik som rekombinante proteiner som uttrykker (for eksempel ved et proteinoverekspresjon). Kloning spiller en rolle

Forskjellige organismer brukes som verter for replikering av kloningsproduktene . Velkjente eksempler er bakterieceller som Escherichia coli- bakterien , encellede alger eller sopp. Vertscellene multipliserer ved celledeling , med identiske kopier av mål-DNA som skal klones produseres. Resultatet er en populasjon av celler som alle inneholder en klon av ønsket DNA-fragment. En passende klon er isolert fra denne populasjonen for videre bruk.

Det klonede DNA kan brukes til å overføre ett eller flere gener til fremmede organismer for å forbedre metabolske prosesser eller for å gi resistens (genetisk manipulasjon hos dyr og planter). Ved en funksjonell kloning blir lignende DNA-sekvenser identifisert ved en posisjonell kloning identifiseres tilstøtende DNA-sekvenser.

Fremgangsmåte

Såkalte vektorer ("genferger") brukes under kloning . Disse tjener som et transportmiddel for overføring av en bestemt DNA-sekvens (kalt transgen eller innsats ) til en mottakercelle og replikering av den. Det er forskjellige metoder for å gjøre disse vektorene mottakelige for fremmed DNA:

Begrensning og ligering

Skjematisk fremstilling av en kloning med begrensning og ligering.

I plasmidet som kloner et plasmid (f.eks. PUC19 ) i løpet av en restriksjonsfordøyelse ved bruk av spesifikke restriksjonsenzymer kuttet forskjøvet slik at overhengende ender (engl. Sticky ender , klebrig ende) oppstår. DNA som skal settes inn er et fragment som ble isolert fra en annen vektor ved hjelp av de samme enzymene, syntetisk DNA med passende overheng eller DNA amplifisert fra genomisk DNA eller cDNA ved bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR) . Før PCR-produktene settes inn i vektoren, kuttes de med de samme enzymene slik at komplementære ender opprettes på vektoren og mål-DNA. De gjensidig kompatible, overhengende ender av vektor og mål-DNA blir funnet og hybridiserer med hverandre. I den påfølgende ligering , som er katalysert av en DNA-ligase (f.eks. T4 DNA-ligase ), er endene på de enkelte strengene kovalent bundet til hverandre . For å redusere bakgrunnen til kloner uten innlegg, brukes vektoren ofte til å fjerne 5'-fosfatgruppen før ligering med fosfatase, f.eks. B. Kalvtarmfosfatase (CIP) behandlet. Dette tillater også effektiv kloning i vektorer som bare har blitt behandlet med ett restriksjonsenzym.

Etter den påfølgende transformasjonen blir rekombinante bakterier valgt ved utplating på agarplater med et passende antibiotikum . Hvis vektorene tillater dette, blir kolonier som ikke inneholder en innsats, screenet ut ved hjelp av blåhvit screening . Dette garanterer heller ikke at alle andre kolonier inneholder ønsket innsats. Derfor er DNA fra individuelle kolonier preget av restriksjonsfordøyelse eller koloni PCR . Hvis resultatet ikke er avgjørende, eller hvis innsatsen ble generert av DNA-amplifikasjon , utføres DNA-sekvensering . Hvis et av enzymene som brukes til å kutte vektoren, etterlater en stump ende , blir PCR-fragmentet kuttet med bare ett enzym.

PCR-kloning

I denne varianten amplifiseres DNA-sekvensen som skal settes inn i en PCR ved bruk av primere som hver inneholder en sekvens i 5'-enden som overlapper med vektoren. Det rensede PCR-produktet er i løpet av ligering under amplifikasjon (PCR-relatert mutagenesereaksjon ) da en megaprimer brukte plasmidet in vitro for å syntetisere. Restriksjonsenzymer og DNA-ligase brukes ikke her. Etter at startplasmider er brutt ned, blir de nylig genererte plasmidene transformert til bakterier for reproduksjon. Ligeringen finner sted etter transformasjonen in vivo . En variant av PCR-kloning er sirkulær klonering av polymerase-forlengelse (CPEC).

TA-kloning

TA-plasmidene er også lineariserte plasmider, men de har et tymidinnukleotid som siste nukleotid som et 3'-overheng, som fungerer som en klebrig ende og gjør det unødvendig å begrense DNA som skal settes inn og plasmidet. Det overhengende tyminnukleotidet er tidligere bundet av en deoksyribonukleotidyltransferase (engelsk terminal deoksynukleotidtransferase ) ved bruk av dideoxy-tyminnukleotider . DNA-sekvensen som skal settes inn må genereres med en termostabil DNA-polymerase av type A (bakteriell opprinnelse), siden type B-polymeraser ikke skaper et overheng. Etter ligering blir plasmidet transformert til bakterier for formering. TA-kloning unngår bruk av restriksjonsenzymer, men tillater ikke målrettet orientering av innsatsen i vektoren, som et resultat av hvilket genekspresjon bare kan finne sted i omtrent 50% av de transgene vektorene. Derfor brukes TA-vektorer ofte i kombinasjon med en blå-hvit screening som rene kloningsvektorer .

TOPO kloning

TOPO- plasmider blir linearisert ved restriksjonsfordøyelse og deretter koblet kovalent med en topoisomerase fra vaccinia-viruset (et koppevirus ), som forårsaker ligering av et PCR-produkt og derfor ikke lenger krever en ligase. Den kovalente bindingen av topoisomerasen skjer automatisk til en DNA-sekvens ved 3'-fosfatenden av sekvensen 5'- (C / T) CCTT-3 '. TOPO- kloningsvektorer er tilgjengelige som TA-vektorer og som stump-end- vektorer. Plasmidet blir deretter transformert til bakterier for reproduksjon. Siden orienteringen av innsatsen i vektoren er tilfeldig, brukes disse vektorene som rene kloningsvektorer. Hvis det første trinnet er å generere en uttrykksklon , brukes toveis TOPO- vektorer. Ofte brukes ensrettede inngangsvektorer også til gateway- systemet . TOPO og Gateway er registrerte varemerker for Thermo Fisher Scientific .

Isoterm montering

Ved isotermisk montering være ved PCR eller kunstig gensyntese produsert DNA-fragmenter uten behov for å bli behandlet med disse restriksjonsenzymer som tidligere er satt inn i en linearisert vektor. Gibson Assembly , som ble utviklet av Daniel G. Gibson ved J. Craig Venter Institute , brukes ofte . Det tillater sømløs kloning av ett eller flere fragmenter i en vektor i et enkelt trinn . Forutsetningen er at molekylene som skal ligeres har sekvensoverlapping på ca. 20 nukleotider . Ved inkubasjon med dNTP og en cocktail av tre enzymer, en exonuklease ( T5- exonuklease ), som forkorter molekylene fra 5'- enden og slik lar molekylene hybridisere , en DNA-polymerase ( Phusion DNA-polymerase), blir de resulterende hullene lukket, og en termostabil DNA-ligase ( Taq DNA-ligase ), som forårsaker en ringlukking, skaper plasmider som kan transformeres direkte. Gibson Assembly er et registrert varemerke for New England Biolabs .

LIC og SLIC

I en ytterligere kloningsvariant ( ligeringsuavhengig kloning , LIC), er PCR-produktet forsynt med en LIC-sekvens. Ved hjelp av 3 '→ 5' eksonukleaseaktiviteten til T4 DNA-polymerase , genereres komplementære overheng i vektoren og i PCR-produktet i nærvær av et dNTP . Ligeringen av det glødede produktet finner sted etter transformasjonen in vivo . En videre utvikling av metoden er SLIC, sekvensen og ligeringsuavhengig kloning som ikke krever en LIC-sekvens. Eksonuklase-aktiviteten stoppes i SLIC-protokoller ved å legge til en dNTP. Hullene i de sirkulære plasmidene dannet etter blanding av DNA-fragmentene repareres etter transformasjon til E. coli- celler.

Gateway-kloning

I en gateway-kloning tilsettes sekvenser til transgenet som inneholder gjenkjenningssekvenser for ligasen attB , som katalyserer inkorporeringen av transgenet i en inngangsvektor . Samtidig fjernes selvmordsgenet ccdB fra inngangsvektoren , noe som betyr at bare transgene organismer med vektorer vokser. En påfølgende utveksling av gensegmenter med en eksisjonase resulterer i en genoverføring fra inngangsvektoren til en målvektor, som hovedsakelig tjener til å uttrykke transgenet og har en annen antibiotikaresistens for senere valg . Som et andre seleksjonstrykk i denne utvekslingen mottar inngangsvektoren ccdB- selvmordsgenet fra målvektoren , noe som betyr at nesten bare organismer med målvektoren som inneholder transgenet vokser.

Kloning av Golden Gate

Den Golden Gate kloning , også kjent som gylden portinnretningen , gjør det mulig samtidig retnings in vitro sammenstilling av flere DNA-fragmenter ved hjelp av typen IIs restriksjonsenzymer og T4 DNA-ligase . Type IIs restriksjonsenzymer brukt i denne metoden, slik som Bsa I, Bsm BI og Bbs I, kuttes utenfor deres gjenkjenningssekvens og kan derfor generere ikke-palindromiske, fire basepar lange overheng som ikke lenger har spaltingspunkter etter ligering. Siden restriksjonsspaltingsstedene ikke er en del av den resulterende konstruksjon, kan restriksjonsfordøyelse og ligering utføres samtidig. Metoden er bl.a. brukt til produksjon av TALEN for genomredigering .

Rekombinasjon

I tilfelle rekombinasjonsprosesser som rekombinering og RMCE-kassettutvekslingsprosessen , finner restriksjon og ligering sted etter at vektoren og innsatsen er transformert in vivo .

Kunstig gensyntese

Ved å bruke forskjellige metoder for kunstig gensyntese kan innsatsene syntetiseres de novo fra primere. De syntetiserte doble strengene inneholder allerede passende ender for ligering i ønsket vektor. Dette kan f.eks. B. utstikkende ender for ligering i en restriksjonsenzymskåret vektor eller sekvensoverlapping for Gibson-samlingen .

Transformasjon og utvalg

Skjematisk fremstilling av transformasjonen av et rekombinant DNA til en bakteriecelle og påfølgende antibiotikaseleksjon.

Dette følges av transformasjon av kompetente bakterieceller (f.eks. E. coli ) med vektorinnsatskonstruksjonen. Den antibiotiske - resistent gen på vektoren tillater seleksjon av bakterielle celler som har tatt opp plasmidet inn i cellen. For dette formål er transformasjonsmetoden på et agar - kulturmedium (f.eks. LB-medium ) ble belagt, av passende antibiotika (f.eks. Ampicillin eller kanamycinholdig ). Så bare de bakteriecellene er valgt som har innlemmet et plasmid. Multiplikasjonen av disse individuelle bakteriecellene skaper bakteriekolonier . Alle utransformerte bakterier som ikke er motstandsdyktige mot antibiotika som brukes, dør. Hvis vektorene er slike. B. pUC19 tillater dette, kolonier som ikke inneholder en innsats, blir skjermet ut ved hjelp av blåhvit screening . For dette formål brukes plater som i tillegg til antibiotika også inneholder X-Gal og IPTG . Utseendet til blå kolonier indikerer tilstedeværelsen av bakterieceller med uendrede vektorer, mens de ufargede koloniene kan inneholde ønsket innsats. Derfor karakteriseres DNA fra individuelle kolonier direkte eller etter amplifisering i væskekultur ved hjelp av restriksjonsfordøyelse eller koloni-PCR . Hvis resultatet ikke er avgjørende, eller hvis innsatsen ble generert av DNA-amplifikasjon , utføres DNA-sekvensering . Et flytende medium inokuleres med en slik koloni for videre reproduksjon. En stor mengde plasmid-DNA kan isoleres fra en slik tilnærming ( plasmidpreparat ). DNA er deretter tilgjengelig for videre kloning eller transformasjon.

litteratur

Individuelle bevis

  1. ↑ J. Quan, J. Tian: Circular polymeraseutvidelse kloning av komplekse genbibliotek og trasé. I: PloS en. Volum 4, nummer 7, 2009, s. E6441, ISSN  1932-6203 . doi: 10.1371 / journal.pone.0006441 . PMID 19649325 . PMC 2713398 (fri fulltekst).
  2. ^ TA Holton, Graham, MW: En enkel og effektiv metode for direkte kloning av PCR-produkter ved bruk av ddT-tailed vektorer . I: Nucleic Acids Research . 19, nr. 5, 11. mars 1991, s. 1156. doi : 10.1093 / nar / 19.5.1156 . PMID 2020554 . PMC 333802 (fri fulltekst).
  3. ^ Y. Ichihara, Y. Kurosawa: Konstruksjon av nye T-vektorer for direkte kloning av PCR-produkter. I: Gene (1993), bind 130 (1), s. 153-154. PMID 8344524 .
  4. ^ MY Zhou, CE Gomez-Sanchez: Universal TA-kloning. I: Curr Issues Mol Biol. (2000), bind 2 (1), s. 1-7. PMID 11464915 .
  5. ↑ L. Geng, W. Xin, DW Huang, G. Feng: En universell kloningsvektor ved bruk av vaccinia topoisomerase I. I: Mol Biotechnol. (2006), bind 33 (1), s. 23-28. PMID 16691003 .
  6. ↑ C. Cheng, S. Shuman: DNA-strengoverføring katalysert av vaccinia topoisomerase: ligering av DNA som inneholder et 3'-mononukleotidoverheng. I: Nucleic Acids Res. (2000), bind 28 (9), s. 1893-1898. PMID 10756188 ; PMC 103307 (fri fulltekst).
  7. ↑ SG Morham, S. Shuman: kovalente og ikke-kovalente DNA-binding med mutanter av vaccinia-DNA topoisomerase I. In: . J Biol Chem (1992), bind 267 (22), s 15984 til 15992.. PMID 1322412 .
  8. Sek J. Sekiguchi, S. Shuman: Proteolytisk fotavtrykk av vaccinia topoisomerase bundet til DNA. I: J Biol Chem. (1995), bind 270 (19), s. 11636-11645. PMID 7744804 .
  9. ↑ Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO.: Enzymatisk samling av DNA-molekyler opp til flere hundre kilobaser . I: Naturmetoder . 6, nr. 5, 2009, s. 343-345. doi : 10.1038 / nmeth.1318 . PMID 19363495 .
  10. ↑ RM Benoit, C. Ostermeier, M. Geiser, JS Li, H. Widmer, M. Auer: Sømløs Insert-Plasmid Forsamling ved høy effektivitet og lave kostnader. I: PloS en. Volum 11, nummer 4, 2016, s. E0153158, doi: 10.1371 / journal.pone.0153158 , PMID 27073895 , PMC 4830597 (gratis fulltekst).
  11. ↑ RS Haun, IM Serventi, J. Moss: Rapid, pålitelig ringsuavhengig kloning av PCR-produkter ved å bruke modifiserte plasmid-vektorer. I: BioTechniques (1992), bind 13 (4), s. 515-518. PMID 1362067 .
  12. ↑ MZ Li, SJ Elledge: Utnyttelse av homolog rekombinasjon in vitro for å generere rekombinant DNA via SLIC. I: Naturmetoder. Volum 4, nummer 3, mars 2007, s. 251-256, doi: 10.1038 / nmeth1010 , PMID 17293868 .
  13. ↑ D. Esposito, LA Garvey, CS Chakiath: Gateway kloning for proteinekspresjon. I: Metoder i molekylærbiologi. Volum 498, 2009, s. 31-54, doi : 10.1007 / 978-1-59745-196-3_3 , PMID 18988017 .
  14. ↑ C. Engler, R. Kandzia, S. Marillonet: A One Pot, ett skritt, Precision Cloning metode med høy overføringskapasiteten . I: PLOS One Volume 3 (11), 2008, e3647, PMID 18985154 .
  15. ^ E. Weber, C. Engler, R. Gruetzner, S. Werner, S. Marillonnet: Et modulært kloningssystem for standardisert montering av multigenkonstruksjoner. I: PloS en. Volum 6, nummer 2, 2011, s. E16765, doi: 10.1371 / journal.pone.0016765 , PMID 21364738 , PMC 3041749 (gratis fulltekst).
  16. ↑ C. Engler, R. Kandzia, S. Marillonnet: A en gryte, ett skritt, presisjon kloningsmetode med høy overføringskapasiteten. I: PloS en. Volum 3, nummer 11, 2008, s. E3647, doi: 10.1371 / journal.pone.0003647 , PMID 18985154 , PMC 2574415 (fri fulltekst).
  17. ^ NE Sanjana, L. Cong, Y. Zhou, MM Cunniff, G. Feng, F. Zhang: A Transcription Activator-Like Effector Toolbox for Genome Engineering . I: Nature Protocols Volume 7 (1), (2012), s. 171-192. PMID 22222791 .
  18. Rich Ulrich Helmich: Påvisning av klonede celler