Gram flekk
Den gramfarging (eller Gram stain ) er en metode som er utviklet av den danske bacteriologist Christian Gram (1853-1938) for å differensiere farging av bakterier for mikroskopisk undersøkelse. Det gjør det mulig å dele bakterier i to store grupper som avviker i struktur av celleveggene. Det skilles mellom gram-positive og gram-negative bakterier. Imidlertid klassifiserer ikke alle arter av bakterier ved denne teknikken være, så det er gramvariabler og grambestemte arter.
betydning
Gramfarging er et verdifullt diagnostisk verktøy innen vitenskapelig og medisinsk mikrobiologi : Med hjelpen kan bakterier lett skille seg ut fra strukturen til celleveggen , siden bakteriens forskjellige fargingsegenskaper er basert på deres kjemiske og fysiske egenskaper. Forskjellen i celleveggens struktur er et viktig systematisk særtrekk ved bakterier, så differensiering ved hjelp av Gram-farging fungerer som et taksonomisk trekk.
Viktig Gram farging er i diagnosen av smittsomme sykdommer . Grampositive og gramnegative bakterier kan ofte bare bekjempes med forskjellige antibiotika . Etter at den bakterielle smøre har tørret (ca. 5-15 minutter, avhengig av materialtype) og faste (vanligvis varmefiksering ved kort å trekke den tre ganger i løpet av en sterk flamme (gassbrenner)), blir “sorg atferd” bestemt i omtrent fem minutter. Dette betyr at legen umiddelbart kan starte antibiotikabehandling før resultatet av minst 24-timers dyrking av patogenet med følgende bestemmelse er tilgjengelig.
Fargemetode
I Gram-farging av bakteriene med et grunnleggende fargestoff etter farging (et grunnleggende anilinfargestoff, vanligvis krystallfiolett ) ved behandling med Lugols løsning (som inneholder et jod - Kaliumjodid - kompleks ) et fargestoff-jodkompleks i dannede bakterier. I motsetning til det primære fargestoffet er dette fargekomplekset uoppløselig i vann. Derimot er den løselig i etanol og ekstraheres derfor fra gramnegative bakterier ved behandling med etanol. På grunn av det tykkere mureinlaget , derimot, blir det ikke ekstrahert fra gram-positive bakterier under forholdene med gramfarging med etanol.
Fargeprosessen består av tre trinn:
- Fargelegging : Det første trinnet er å fargelegge med en løsning av krystallfiolett ( gentian violet ) som det tilsettes 15 g / l fenol ( karbolsyre ), den såkalte "carbolic gentian violet". Her farges alle bakterier, både gram-positive og gram-negative. Under den påfølgende behandlingen med Lugols løsning dannes større fargekomplekser , og alle bakterier virker mørkeblå.
- Avfarging ("differensiering"): Det andre trinnet er behandling med 96% etanol . Gram-positive og Gram- negative bakterier oppføre seg på en annen måte: Gram- negative bakterier blir raskt avfarget igjen, mens de blå farve komplekser fra Gram-positive bakterier kan bare bli vasket ut etter mye lengre behandling med etanol.
- Motfarging : For å vise de gramnegative bakteriene kan de motflekkes med fortynnet fuchsine- oppløsning (en oppløsning av fuchsine med fenol i omtrent 1/10 av de vanlige konsentrasjonene av "carbol fuchsine ") eller safraninløsning , hvorpå de fremstår som røde eller rød appelsin.
Behandlingene med Lugols løsning og med alkohol er de avgjørende trinnene i Gram-farging.
Årsaker til ulik fargestoffer
Forskjellen i fargen ifølge Gram skyldes strukturen på celleveggen:
1. Gram- positive celleveggen
2. Gram- negative celleveggen
3. peptidoglykan (Murein)
4. plasmamembranen
5. Cytoplasm
6. periplasmatiske rom , i grampos. Bakterier indre veggsone (IWZ)
7. ytre membran
-
Grampositive bakterier har et tykt, flerlags "mureinskall" (bestående av peptidoglykaner eller "murein") avsatt på membranen . Dette kan utgjøre opptil 50% av den tørre skallmassen. I tillegg inneholder celleveggen mellom 20% og 40% lipoteichoinsyrer . Lugols løsning samles i mellomrommene i Murein-konvolutten. Her har alkoholen dehydratiserende effekt og reduserer avstanden mellom molekylene slik at fargekompleksene ikke kan vaskes ut av alkoholen. Den mørkeblå fargen beholdes dermed.
Eksempler på grampositive bakterier er alle arter av Actinobacteria- stammen , slik som de av slektene Actinomyces og Streptomyces , og nesten alle arter av Firmicutes- stammen , slik som de av slektene Streptococcus , Enterococcus , Staphylococcus , Listeria , Bacillus , Clostridium , Lactobacillus og arten Erysipelothrix rhusiopathiae .
-
Gramnegative bakterier har derimot bare et tynt, enkeltlags mureinskall. Dette utgjør bare omtrent 10% av den tørre massen til bakterieskallet og inneholder ingen teikonsyrer. I tillegg er en annen er det også lipid - membranen overlagret. Alkoholen har en lipidoppløsende effekt, slik at den avsatte lipidmembranen oppløses og det tynne mureinskallet blir eksponert. Fargestoffkompleksene vaskes ut av alkoholen - bakterien avfarges igjen . De gramnegative bakteriene farges deretter rødt ved motfarging med fuchsine.
Eksempler på gramnegative bakterier er alle arter av avdelingen Proteobacteria , slik som enterobakterier ( Escherichia coli , Salmonella , Shigella , Klebsiella , Proteus , Enterobacter ) samt slektene Pseudomonas , Legionella , Neisseria , Rickettsia og arten Pasteurella multocida ; Representanter for andre avdelinger, som Streptobacillus moniliformis (en art av Fusobacteria- stammen ), Meningococcus , Chlamydophila , Chlamydia , spirochetes , alle arter av Bacteroidetes- stammen og cyanobakteriene . I tillegg er arten av slekten Veillonella av familien Acidaminococcaceae (stamme Firmicutes ) gramnegative, selv om alle andre arter av stammen Firmicutes er grampositive.
Alternativer til Gram-flekk
Følgende korte tester kan brukes til å skille bakterier basert på samme celleveggskarakteristikker som med Gram-flekk:
KOH-test
En liten mengde av bakteriemasse (fra en agar- kultur) blir suspendert i en dråpe 3% kalium- hydroksyd -løsning . Når det gjelder gram-positiv , er denne luten for svak til å lysere celleveggen . Hvis du drar en nål eller tannpirker gjennom blandingen, oppfører den seg som en væske med en viskositet som vann (ingen tråddannelse kan sees). Den celleveggen av gramnegative bakterier, på den annen side er mye tynnere og ble lysert ved den kalilut. Cellene brytes opp og DNA frigjøres. Hvis nålen trekkes gjennom denne løsningen, kan tråddannelse observeres på grunn av økt viskositet på grunn av frigitt DNA. Det skal understrekes at dette er en rask test som bare er delvis pålitelig. Det er ofte vanskelig for nybegynnere å se tråddannelse. Bruk av feil alkalikonsentrasjon kan også være en feilkilde her. Hvis dette er for sterkt, vil også grampositive bakterier lyseres . På den annen side, hvis den er for svak, lyses heller ikke gramnegative bakterier.
Aminopeptidasetest
Den aminopeptidaseprøve er basert på det faktum at enzymet L-alanin aminopeptidase , med noen få unntak, kan bare påvises i gram-negative bakterier. En liten mengde av bakteriene som skal undersøkes, suspenderes i litt sterilt , destillert vann i et prøverør eller mikro-reaksjonsbeholder . For påvisning brukes L- alanin-4-nitroanilid, som spaltes av enzymet med spaltning av en amidbinding i L- alanin og den gulfargede 4-nitroanilin. En gul farging av suspensjonen indikerer således tilstedeværelsen av en gramnegativ bakterie. Industrielt produserte teststrimler er tilgjengelige for denne reaksjonen. Det anbefales at du alltid inkluderer en negativ kontroll for å kunne sammenligne. I tillegg kan testen bare brukes til bakteriekolonier uten sterk iboende farge.
historie
Den danske legen Hans Christian Gram utviklet fargemetoden mens han jobbet for Carl Friedländer i Berlin. Han lette etter en fargemetode som bakterier kan representeres i dyrevev, dvs. farges på en måte som kontrasterer dem med vevscellene. Fargemetoden som ble funnet, publisert i 1884, var bare vellykket med noen bakterier, de gram-positive. Émile Roux anvendte metoden for å differensiere gram-positive og gram-negative bakterier ved farging, spesielt for å bestemme gonokokker (gram-negative i motsetning til mange andre kokker) (publisert i 1886).
Videre utvikling
Forskere ved Harvard University i Boston (USA) har utviklet Gram-farging til en magnetisk deteksjonsmetode. Etter farging med modifisert krystallfiolett , er magnetiske nanopartikler festet til fargestoffet. Bakteriene kan deretter oppdages ved hjelp av NMR-enheter og separeres magnetisk. Fordelen med magnetisk deteksjon er dens høye følsomhet. Ved hjelp av miniatyriserte mikro-NMR-enheter er rask og sensitiv diagnose på stedet tenkelig.
litteratur
- C. Gram: Om den isolerte fargen på schizomycetene i skiver og tørre prøver. I: Fremskritt i Medicin . Vol. 2, 1884, s. 185-189.
- Steve K. Alexander, Dennis Strete: Grunnleggende mikrobiologisk internship - et fargeratlas. Pearson, München 2006, ISBN 978-3-8273-7201-7 .
weblenker
Individuelle bevis
- ^ Carl Roth GmbH + Co. KG: Instruksjoner for farging av gram. Tilgang 15. april 2020 (tysk).
- ↑ Benoît Zuber et al. : Granular Layer in the Periplasmic Space of Gram-Positive Bacteria and Fine Structures of Enterococcus gallinarum and Streptococcus gordonii Septa Revealed by Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections In: J Bacteriol 2006, 188 (18): 6652-6660. PMC 1595480 (gratis fulltekst).
- ^ Wissenschaft-Online-Lexika: Entry on Murein in the Lexikon der Biologie, åpnet 22. november 2008.
- ↑ Ghyslain Budin, Hyun Jung Chung, Hakho Lee, Ralph Weissleder: A Magnetic Gram Stain for Bacterial Detection . I: Angewandte Chemie . teip 124 , nr. 24 , 2012, doi : 10.1002 / anie.201202982 .