DNA-sekvensering

DNA-sekvensering er bestemmelsen av nukleotidet -Abfolge i et DNA - molekyl . DNA-sekvensering revolusjonerte de biologiske vitenskapene og innledet genomikkens tid . Siden 1995 har genomet på over 50000 (fra og med 2020) forskjellige organismer blitt analysert ved hjelp av DNA-sekvensering . Sammen med andre DNA-analysemetoder brukes DNA-sekvensering bl.a. brukes også til å undersøke genetiske sykdommer . I tillegg er DNA-sekvensering en sentral analytisk metode , spesielt i sammenheng med DNA-kloning .molekylær kloning ), en uunnværlig del av et molekylært biologisk eller genteknisk laboratorium i dag.

Problem

DNA-sekvensering som å lese nukleotidsekvensen til DNA var et uløst problem i flere tiår fram til midten av 1970-tallet, da passende biokjemiske eller bioteknologiske metoder ble utviklet. I dag har selv sekvensering av hele genomer blitt relativt raskt og enkelt.

Imidlertid er utfordringene ved genomsekvensering ikke begrenset til direkte avlesning av nukleotidsekvensen. Avhengig av prosedyren leses bare korte DNA-seksjoner ( leser ) opp til maksimalt 1000 basepar i hver enkelt sekvenseringsreaksjon på grunn av tekniske begrensninger . Etter å ha oppnådd sekvensen til den neste vil deretter primer (som har en sekvens fra slutten av forrige sekvensering), som som en primergang eller hele kromosomer som kromosomgang kalles og ble først brukt i 1979.

Et større sekvenseringsprosjekt, som Human Genome Project , som sekvenserte milliarder av basepar, krever derfor en tilnærming kjent som hagle-sekvensering . Lengre DNA-seksjoner blir først brutt ned i mindre enheter, disse blir deretter sekvensert, og sekvensinformasjonen til de enkelte korte seksjonene blir deretter kombinert igjen for å danne en komplett total sekvens ved hjelp av bioinformatiske metoder. For å oppnå biologisk relevant informasjon fra de rå sekvensdataene (for eksempel informasjon om eksisterende gener og deres kontrollelementer), følges sekvenseringen av DNA-sekvensanalysen . Uten dem har sekvensinformasjon ingen vitenskapelig verdi.

Sekvenseringsmetoder

DNA-sekvenseringsutstyr

Det er flere metoder i dag for å lese sekvensinformasjonen fra et DNA-molekyl. I lang tid var hovedsakelig videreutvikling av Frederick Sanger- metoden i bruk. Moderne metoder gir muligheten for akselerert sekvensering gjennom høyst parallell bruk. Utviklet av Sanger-metoden blir sekvenseringsmetoder ofte kalt henholdsvis neste generasjons sekvensering ( Engl. Next generation sequencing ).

Klassiske metoder

Metoden til Maxam og Gilbert

Metoden til Allan Maxam og Walter Gilbert fra 1977 er basert på den basisspesifikke kjemiske spaltningen av DNA ved bruk av egnede reagenser og påfølgende separering av fragmentene ved denaturering av polyakrylamidgelelektroforese . DNA merkes først i en 5 'eller 3' ende med radioaktivt fosfat eller et ikke-radioaktivt stoff ( biotin , fluorescein ). I fire separate tilnærminger blir visse baser deretter delvis (begrenset) modifisert og delt fra sukkerfosfat-ryggraden i DNA, for eksempel blir basen guanin (G) metylert av reagens dimetylsulfat og fjernet ved alkalibehandling med piperidin . Da er DNA-strengen splittet helt. I hver tilnærming oppstår fragmenter av ulik lengde, hvor 3'-enden alltid har blitt spaltet på visse baser. Denaturerende polyakrylamid gel elektroforese skiller fragmentene i henhold til lengde, ulikheter i lengde blir løst av en base. Sekvensen av DNA kan avleses ved å sammenligne de fire tilnærmingene på gelen. Denne metoden gjorde det mulig for oppfinnerne å bestemme operonsekvensen til et bakteriell genom. Metoden brukes sjelden i dag fordi den krever farlige reagenser og er vanskeligere å automatisere enn Sanger dideoxy-metoden utviklet samtidig.

Dideoxy-metode ifølge Sanger

Den Sanger-dideoksy-metoden kalles også kjedeterminering syntese . Det er en enzymatisk metode, den ble utviklet av Sanger og Coulson rundt 1975 og ble presentert allerede i 1977 med den første komplette sekvenseringen av et genom ( bakteriofag φX174 ). Sanger mottok Nobelprisen i kjemi i 1980 for sitt arbeid med DNA-sekvensering sammen med Walter Gilbert og Paul Berg .

Prinsipp for DNA-sekvensering i henhold til dideoxy-metoden.
dNTP er den generelle forkortelsen for et nukleosidtrifosfat og kan stå for dATP, dCTP, dGTP eller dTTP. ddNTP er de tilsvarende dideoxy-variantene av dNTPene. Innlemmelsen av et ddNTP fører til avslutningen av polymerisasjonsreaksjonen. De blå prikkene i 5'-enden av primeren representerer en markering (f.eks. En fluorescerende gruppe) ved hjelp av hvilken synteseproduktene senere kan synliggjøres i gelen. Alternativt kan radioaktivt merkede nukleosidtrifosfater også brukes til polymerisasjonsreaksjonen.

Med utgangspunkt i en kort seksjon av kjent sekvens ( primer ) utvides en av de to komplementære DNA-strengene med en DNA-polymerase . For det første denatureres DNA-dobbeltspiralen ved oppvarming, hvorpå enkeltstrenger er tilgjengelige for videre prosedyre. I fire ellers identiske batcher (alle inneholder de fire nukleotidene, hvorav den ene er radioaktivt merket), blir en av de fire basene tilført delvis som dideoxynukleosidtrifosfat (ddNTP) (dvs. en batch med enten ddATP, ddCTP, ddGTP eller ddTTP). Disse kjedeavslutning ddNTP har ikke en 3'-hydroksylgruppe: Hvis de er innlemmet i den nylig syntetiserte strengen, kan DNA-polymerasen ikke lenger utvide DNA fordi OH-gruppen på 3'-C-atomet er ansvarlig for koblingen med fosfatgruppen i neste nukleotid mangler. Som et resultat blir DNA-fragmenter av forskjellige lengder opprettet, som alltid ender med samme ddNTP i hver enkelt batch (dvs. bare med A eller C eller G eller T for hver batch). Etter sekvenseringsreaksjonen skilles de markerte termineringsproduktene fra alle batcher på langs ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese . Ved å sammenligne de fire tilnærmingene kan sekvensen etter eksponering av den radioaktive gelen leses på fotografisk film ( røntgenfilm ). Den tilsvarende komplementære sekvensen er sekvensen til den enkeltstrengede DNA- malen som brukes . I dag brukes en variant av polymerasekjedereaksjonen (PCR) som en sekvenseringsreaksjon . I motsetning til PCR brukes bare en primer, slik at DNA bare forsterkes lineært.

En radioaktiv metode for DNA-sekvensering, ved å overføre DNA-molekylene til en bærer under elektroforetisk separasjon, ble utviklet av Fritz M. Pohl og hans gruppe tidlig på 1980-tallet. "Direct-Blotting-Electrophoresis System GATC 1500" ble markedsført av Konstanz-selskapet GATC Biotech. DNA-sekvensereren var f.eks. B. brukt som en del av det europeiske genomprosjektet for sekvensering av kromosom II av gjæren Saccharomyces cerevisiae .

Siden begynnelsen av 1990-tallet har dideoxynukleosidtrifosfater merket med fluorescerende fargestoffer blitt brukt. Hver av de fire ddNTP-ene er kombinert med et annet fargestoff. Denne modifiseringen gjør at alle fire ddNTPer kan legges til i en reaksjonsbeholder, splittes i separate grupper, og håndtering av radioisotoper er ikke nødvendig. De resulterende kjedeavslutningsproduktene separeres ved hjelp av kapillærelektroforese og eksiteres til fluorescens ved hjelp av en laser. DdNTP-ene på slutten av hvert DNA-fragment viser fluorescens i forskjellige farger og kan dermed gjenkjennes av en detektor. Elektroferogrammet (sekvensen av fargesignaler som vises på detektoren) viser direkte sekvensen til basene til den sekvenserte DNA-strengen.

Moderne tilnærminger

Med den økende betydningen av DNA-sekvensering i forskning og diagnostikk, er det utviklet metoder som tillater økt gjennomstrømning. Det er nå mulig å sekvensere det komplette menneskelige genomet på omtrent 8 dager. Disse prosedyrene er som sekvensering av henholdsvis andre generasjon ( engl. 2. generasjons sekvensering ). Ulike selskaper har utviklet prosesser med forskjellige fordeler og ulemper. Det er andre enn de som er oppført her. Andre generasjons DNA-sekvensering ble kåret til Årets metode 2007 av bladet Nature Methods .

Pyrosekvensering

Rå data (sentrum) inkludert DNA-sekvens (til høyre) vist i OpenChrom

Som Sanger-sekvensering bruker pyrosekvensering en DNA-polymerase for å syntetisere den motsatte DNA-strengen, selv om typen DNA-polymerase fremdeles kan være forskjellig. DNA-blandingen blir ligert med en DNA-adapter og koblet til perler via en komplementær adapter-sekvens . Perlene fylt med DNA plasseres på en plate med porer på størrelse med en perle , der en lysføring fører til en detektor under hver pore. DNA-polymerase blir så å si observert "i aksjon" da den suksessivt fester individuelle nukleotider til en nysyntetisert DNA-streng. Den vellykkede innlemmelsen av et nukleotid omdannes til et lysglimt av et sofistikert enzymsystem med deltagelse av en luciferase og registrert av en detektor. DNA som skal sekvenseres fungerer som en malstreng og er enkeltstrenget. Fra og med en primer blir strengen forlenget, nukleotid for nukleotid, ved å tilsette en av de fire typene deoksynukleosidtrifosfater (dNTP) i hvert tilfelle . Et signal oppnås når det passende (komplementære) nukleotidet tilsettes. Hvis en NTP som ikke stemmer overens på dette tidspunktet, er lagt til, vil ikke lysblitsen bli hørt. Etter det blir eksisterende NTP ødelagt og en annen art blir lagt til; dette fortsetter til det er en ny reaksjon; Etter det fjerde tilskuddet er det en reaksjon siden alle typer NTP ble prøvd ut.

Når et komplementært nukleotid er inkorporert av DNA-polymerasen, frigjøres pyrofosfat (PP i ). Pyrofosfat omdannes til adenosintrifosfat (ATP) av ATP-sulfurylase . ATP driver luciferase-reaksjonen, som omdanner luciferin til oksyluciferin. Dette resulterer igjen i et påvisbart lyssignal - hvis styrke er proporsjonal med ATP-forbruket.

Pyrosekvensering brukes for eksempel for å bestemme frekvensen av visse genmutasjoner (SNP, enkelt nukleotid polymorfisme ), f.eks. B. brukt i etterforskningen av arvelige sykdommer. Pyrosekvensering er lett å automatisere og er egnet for svært parallell analyse av DNA-prøver.

Sekvensering ved hybridisering

For dette formålet er korte DNA-segmenter ( oligonukleotider ) festet i rader og kolonner på et glassbilde ( DNA-chip eller mikroarray ) . Fragmentene av DNA som skal sekvenseres er merket med fargestoffer og fragmentblandingen påføres oligonukleotidmatrisen slik at komplementære faste og frie DNA-segmenter kan hybridisere med hverandre. Etter å ha vasket ut ubundne fragmenter, kan hybridiseringsmønsteret leses ut av fargemarkeringene og deres styrke. Siden sekvensene av de faste oligonukleotidene og deres overlappingsområder er kjent, kan konklusjoner til slutt trekkes fra fargemønsteret om den underliggende generelle sekvensen av det ukjente DNA.

Ion halvleder-DNA-sekvenseringssystem

Denne metoden til Ion Torrent bruker halvlederprosess i orden ved hjelp av integrerte kretser, et direkte ikke-optisk genom utfører sekvensering. Sekvenseringsdataene er hentet direkte fra deteksjonen av halvlederbrikker på ioner som produseres av malavhengige DNA-polymeraser. Brikken som brukes til dette har ionesensitive felteffekt-transistorsensorer som er ordnet i et rutenett på 1,2 millioner brønner der polymerasereaksjonen finner sted. Dette rutenettet muliggjør parallell og samtidig påvisning av uavhengige sekvensreaksjoner. Den komplementære metalloksyd halvlederteknologien ( CMOS ) brukes, som muliggjør en kostnadseffektiv reaksjon med høy tetthet av målepunkter.

Sekvensering med brosyntese

Under sekvensering med brosyntese av Solexa / Illumina blir det dobbeltstrengede DNA som skal sekvenseres, ligert i begge ender med hver sin adapter-DNA-sekvens hver. DNA blir deretter denaturert, etter fortynning, ligert enkeltstrenget på en bærerplate og amplifisert in situ ved broamplifisering. Karakteriserte individuelle regioner dannes på bærerplaten ( klyngen ) med amplifisert DNA som ligger i en klynge av samme sekvens. I en sekvensering ved synteserelatert PCR-reaksjon med fire forskjellige fargede fluorescerende kjedeavslutningssubstrater, bestemmes nukleobasen innebygd i hver syklus i en klynge i sanntid .

To basesekvenser

To- bases sekvensering ( Sequencing by Oligo Ligation Detection , SOLiD) fra Applied Biosystems er en variant av Sequencing by Ligation . Et DNA-bibliotek fortynnes og kobles til mikroperler med en DNA-polymerase , deretter amplifiseres DNA i en emulsjon PCR . Som et resultat inneholder hver mikroperle flere kopier av bare en DNA-sekvens. De mikrokuler er modifisert ved 3'-enden, slik at de kan bli individuelt festet til en bæreplate. Etter at primere er bundet og fire forskjellige spaltbare prober er lagt til , som hver er merket med forskjellige fluorescerende farger og som binder seg til DNA-malen basert på de to første nukleotidene (CA, CT, GG, GC), er en DNA-ligase brukt til ligering. Deretter spaltes probene og frigjør markeringene. Hver base i DNA-sekvensen bestemmes i minst to forskjellige ligeringsreaksjoner ved bruk av opptil fem primere, som hver er satt tilbake en base i sekvensen.

Paret sluttsekvensering

Et tydelig identifiserbart signal kan også oppnås ved å generere korte biter av DNA fra begynnelsen og slutten av en DNA-sekvens ( Paired End Tag Sequencing , PETS) hvis genomet allerede er fullstendig sekvensert.

Tredje generasjon sekvensering

Sekvenseringen av den tredje generasjon for første gang måler responsen av individuelle molekyler som enkelt-molekyl eksperiment , som tidligere sekvense amplifikasjon ved PCR blir eliminert. Dette unngår ujevn amplifisering av termostabile DNA-polymeraser , siden polymeraser fortrinnsvis binder noen DNA-sekvenser og replikerer dem mer intenst ( polymeraseforstyrrelse ). Dette kan føre til at noen sekvenser blir oversett. Videre kan genomet til individuelle celler undersøkes. Opptaket av det utgivne signalet blir spilt inn i sanntid . I tredje generasjon av DNA-sekvensering registreres to forskjellige signaler, avhengig av metoden: frigitte protoner (som en variant av halvleder-sekvensering) eller fluoroforer (med fluorescensdetektor). DNA- og RNA-sekvensering av individuelle celler ble valgt som metode for året 2013 av tidsskriftet Nature Methods .

Nanopore-sekvensering

Nanoporesekvensering er basert på endringer i ionestrømmen gjennom nanoporer som er innebygd i en kunstig opprettet membran. Både biologiske (små transmembrane proteiner som ligner på en ionekanal , f.eks. Α-hemolysin (α-HL) eller ClpX ) og syntetiske porer (laget av silisiumnitrid eller grafen ), så vel som halvsyntetiske porer, brukes som nanoporer . Nanoporen er innebygd i en kunstig membran som har spesielt høy elektrisk motstand. I motsetning til konvensjonelle ionekanaler er porene permanent åpne og tillater således en konstant strøm av ioner gjennom membranen etter at et potensial er påført. DNA-molekyler som passerer gjennom porene reduserer strømmen. Denne nåværende reduksjonen har en spesifikk amplitude for hvert nukleotid , som kan måles og tilordnes det tilsvarende nukleotidet. I enkeltstrengs sekvensering skilles en dobbeltstrenget DNA-streng av en helikase og settes inn i nanoporen. Når det gjelder en MspA-pore, er det fire nukleotider av DNA i porene samtidig. Gjennomgangshastigheten avhenger blant annet av forskjellen i pH på begge sider av membranen. De spesifikke ionestrømendringene for hver av de fire nukleotidene gjør det mulig å lese sekvensen fra datasettet. En evaluering finner sted z. B. med programvaren Poretools . Fordelen med denne metoden er at den har jevn nøyaktighet selv med lange DNA-tråder. En modifikasjon av metoden brukes til proteinsekvensering .

Nanopore-sekvenseringsteknologi markedsføres for eksempel av det britiske selskapet Oxford Nanopore Technologies. Deres "MinION" sequencer var i utgangspunktet bare tilgjengelig via et såkalt "Early Access Program", men har vært tilgjengelig siden 2015 gjennom konvensjonelle salgskanaler.

Hjelpemetoder

litteratur

weblenker

Individuelle bevis

  1. ↑ E. Pettersson, J. Lundeberg, A. Ahmadian: Generasjoner av sekvenseringsteknologier . I: Genomics . teip 93 , nr. 2. februar 2009, s. 105-111 , doi : 10.1016 / j.ygeno.2008.10.003 , PMID 18992322 .
  2. ↑ AC Chinault, J. Carbon: Overlapping hybridisering screening: isolering og karakterisering av overlappende DNA-fragmenter som omgir leu2-genet på gjær-kromosom III. I: Gener. Volum 5 (2), 1979, s. 111-126. PMID 376402 .
  3. ^ A. Maxam, W. Gilbert: En ny metode for sekvensering av DNA. I: Proceedings of the National Academy of Sciences USA Vol. 74, 1977, s. 560-564. PMID 265521 ; PMC 392330 (fri fulltekst).
  4. ↑ F. Sanger et al.: Nukleotidsekvens av bakteriofag phi X174 DNA. I: Natur . Volum 265, 1977, s. 687-695. doi: 10.1038 / 265687a0 ; PMID 870828 .
  5. ↑ F. Sanger et al.: DNA-sekvensering med kjedeterminerende hemmere. I: Proceedings of the National Academy of Sciences USA Vol. 74, 1977, s. 5463-5467. PMID 271968 ; PMC 431765 (fri fulltekst).
  6. ↑ Informasjon fra den Nobelstiftelsen på 1980 prisutdelingen til Walter Gilbert, Paul Berg og Fredrik Sanger (engelsk)
  7. ↑ F. Sanger, Coulson AR: En rask metode for bestemmelse av sekvenser i DNA ved primet syntese med DNA-polymerase. I: Journal of Molecular Biology . Volum 93, 1975, s. 441-448. PMID 1100841 .
  8. ^ S. Beck, FM Pohl: DNA-sekvensering med direkte blotting-elektroforese. I: EMBO-journal . Volum 3, nummer 12, desember 1984, s. 2905-2909. PMID 6396083 . PMC 557787 (fri fulltekst).
  9. ↑ Patent DE3022527
  10. ↑ H. Feldmann, M. Aigle et al ..: Komplett DNA-sekvens av gjærkromosom II. I: The EMBO journal. Volum 13, nummer 24, desember 1994, s. 5795-5809, PMID 7813418 . PMC 395553 (fri fulltekst).
  11. ^ Genomsekvensering: tredje generasjon. 6. februar 2009, åpnet 28. februar 2011 .
  12. ↑ Anonym: Årets metode. I: Naturmetoder. 5, 2008, s. 1, doi: 10.1038 / nmeth1153 .
  13. ↑ M. Ronaghi: pyrosekvensering belyser DNA-sekvensering. I: genomforskning. 11, 2001, s. 3-11. PMID 11156611 doi: 10.1101 / gr.11.1.3 (PDF) (PDF)
  14. M JM Rothberg, W. Hinz, TM Rearick, J. Schultz, W. Mileski, M. Davey, JH Leamon, K. Johnson, MJ Milgrew, M. Edwards, J. Hoon, JF Simons, D. Marran, JW Myers , JF Davidson, A. Branting, JR Nobile, BP Puc, D. Light, TA Clark, M. Huber, JT Branciforte, IB Stoner, SE Cawley, M. Lyons, Y. Fu, N. Homer, M. Sedova, X. Miao, B. Reed, J. Sabina, E. Feierstein, M. Schorn, M. Alanjary, E. Dimalanta, D. Dressman, R. Kasinskas, T. Sokolsky, JA Fidanza, E. Namsaraev, KJ McKernan, A. Williams, GT Roth, J. Bustillo: En integrert halvlederenhet som muliggjør ikke-optisk genom-sekvensering. I: Natur. 475 (7356), 20. juli 2011, s. 348-352. doi: 10.1038 / nature10242
  15. ↑ ER Mardis: Innvirkningen av neste generasjons sekvenseringsteknologi på genetikk. I: Trends Genet. Volum 24 (3), 2008, s. 133-141. doi: 10.1016 / j.tig.2007.12.007 . PMID 18262675 .
  16. ↑ a b c L. Liu, Y. Li, S. Li, N. Hu, Y. He, R. Pong, D. Lin, L. Lu, M. Law: Sammenligning av neste generasjons sekvenseringssystemer. I: J Biomed Biotechnol. Volum 2012, s. 251364. doi: 10.1155 / 2012/251364 . PMID 22829749 ; PMC 3398667 (gratis fulltekst).
  17. ↑ J. Henson, G. Tischler, Z. Ning: Neste generasjons sekvensering og store genomforsamlinger. I: Pharmacogenomics . Volum 13 (8), 2012, s. 901-915. doi: 10.2217 / pgs.12.72 . PMID 22676195 . (PDF)
  18. ↑ X. Ruan, Y. Ruan: Genom bred transkripsjonsanalyse med 5 'og 3' parret end-tag neste generasjons sekvensering (RNA-PET). I: Methods Mol Biol. Bind 809, 2012, s. 535-562. doi : 10.1007 / 978-1-61779-376-9_35 . PMID 22113299 .
  19. J MJ Fullwood, CL Wei, ET Liu, Y. Ruan: Neste generasjons DNA-sekvensering av sammenkoblede tagger (PET) for transkriptom- og genomanalyser. I: Genome Res. Bind 19 (4), 2009, s. 521-532. doi: 10.1101 / gr.074906.107 . PMID 19339662 . (PDF)
  20. ↑ F. Ozsolak: Tredje generasjons sekvense teknikker og applikasjoner til medisiner. I: Expert Opin Drug Discov . Volum 7 (3), 2012, s. 231-243. doi: 10.1517 / 17460441.2012.660145 . PMID 22468954 ; PMC 3319653 (gratis fulltekst).
  21. ↑ CS Pareek, R. Smoczynski, A. Tretyn: Sekvense teknologier og genomsekvensering. I: J Appl Genet. Volum 52, utgave 4, 2011, s. 413-435. doi: 10.1007 / s13353-011-0057-x . PMID 21698376 ; PMC 3189340 (fulltekst).
  22. ↑ Årets metode 2013. I: Naturmetoder. 11, 2013, s. 1, doi: 10.1038 / nmeth.2801 .
  23. ↑ J. Nivala, DB Marks, M. Åkeson: Unfoldase-mediert proteintranslokasjon gjennom en α-hemolysin nanopore. I: Nature Biotechnology . Volum 31, nummer 3, mars 2013, s. 247–250, doi: 10.1038 / nbt.2503 . PMID 23376966 . PMC 3772521 (fri fulltekst).
  24. ↑ AH Laszlo, IM Derrington, BC Ross, H. Brinkerhoff, A. Adey, IC Nova, JM Craig, KW Langford, JM Samson, R. Daza, K. Doering, J. Shendure, JH Gundlach: Decoding long nanopore sequencing lies av naturlig DNA. I: Nature Biotechnology . Volum 32, nummer 8, august 2014, s. 829-833, doi: 10.1038 / nbt.2950 . PMID 24964173 . PMC 4126851 (fri fulltekst).
  25. And BN Anderson, M. Muthukumar, A. Meller: pH-innstilling av DNA-translokasjonstid gjennom organisk funksjonaliserte nanoporer. I: ACS Nano . Volum 7, nummer 2, februar 2013, s. 1408-1414, doi: 10.1021 / nn3051677 . PMID 23259840 . PMC 3584232 (fri fulltekst).
  26. ↑ NJ Loman, AR Quinlan: Poretools: et verktøy for analyse av nanoporesekvensdata. I: Bioinformatikk. Volum 30, nummer 23, desember 2014, s. 3399-3401, doi: 10.1093 / bioinformatics / btu555 . PMID 25143291 .
  27. ↑ Y. Yang, R. Liu, H. Xie, Y. Hui, R. Jiao, Y. Gong, Y. Zhang: Fremskritt i nanopore sekvenseringsteknologi. I: Journal of nanoscience and nanotechnology. Volum 13, nummer 7, juli 2013, s. 4521-4538. PMID 23901471 .
  28. ↑ Begynn å bruke MinION ( minner fra 23. januar 2016 i Internett-arkivet ), åpnet 23. mars 2016.